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1、 成骨细胞培养 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-成骨诱导液：地塞米松，-磷酸甘油，维生素 C，OB 或 3T3-E1：-MEM+10%FBS+50ug/mlascorbic acid+10mM-glycerophosphate PG(磷酸甘油)和 Vc 配好放四度，Vc 尽量分装保存，减少与空气接触，三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配 成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷 PBS 中，剔除附着的结缔组织。用 PBS 液清洗 3 次，将其置入盛有 DMEM 培养基的培养皿中，剪成 mm mm 大小碎块，约 30 块，加入%胰
2、蛋白酶 5 mL，置入孵箱中消化 20 min，血清终止消化，弃上清液，加入 g/L 型胶原酶 10 mL，置于孵箱中消化 90 min，1 000 r/min 离心 10 min，使细胞沉淀，用 PBS 洗涤细胞 2 次，200 目滤网过滤去除骨碎片。所沉淀物以含体积分数 10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素，100 mg/L链霉素的 DMEM 培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个 25 cm2 培养瓶。于37，含体积分数 5%CO2 培养箱培养。48 h 后换液，以后隔日换液 1 次。成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过 程中，每 48 h 换液 1 次至细胞融合成单层，密度长至
3、 80%融合时，13 的比例进行传代培养。将原代培养细胞用%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。成骨细胞鉴定：活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。Giemsa 染色：将纯化后的第 2 代细胞调整细胞浓度至 5107 L-1，接种到 12 孔细胞培养板中，每孔接种 mL，以后每 3 d 换液。待细胞分布均匀、约 80%融合时，PBS 洗 3 次，甲醇固定 10 min，Giemsa 染液染 2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数 95%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶
4、活性检测试剂盒要求进行检测。核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。茜素红染液 操作 1.成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用1PBS 冲洗 1-2 次。每孔加入 2 mL 4%中性甲醛溶液，固定 30 min。2.吸走中性甲醛溶液，用 1PBS 冲洗 2 次。每孔中加入 1 mL 茜素红染液染 3-5 min。3.吸走茜素红染液，用 1PBS 冲洗 2-3 次。4.将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。用 4 周龄大鼠，用全骨髓贴壁法取得原代细胞，消化传代，用第 3 代培养至80-90%融合后，胰酶消化，接种在事先
5、明胶包被的六孔板中，当细胞生长达接近80-90%时，使用 cyagen 的成骨诱导培养液诱导，每 2-3 天换液，诱导 28 天后，吸去六孔板中培养基，用 PBS 冲洗，加入 4%中性甲醛固定 30min，再次用 PBS 冲洗，加入茜素红染 4min，PBS 冲洗后观察。骨科手术中获得成 人松质骨，经 PBS 或者 D-Hanks 液冲洗数次后剪成 1 3 mm3 左右小粒，在 1%庆大霉素中浸泡 30 min。如不能立即使用，可浸泡于含 12%胎牛血清及青霉素、链霉素的 Hams F12 培养液中，放在 4冰箱过夜。用 PBS 或者 D-Hanks 反复冲洗至小骨粒发白，移入小瓶中，加 0.25%胰蛋白酶，37孵箱中消化 20 min，弃去上清。剩余小粒移入培养瓶，加入 Hams F12 培养液，将培养瓶竖放或瓶底向上，并使小粒均匀分布;将培养瓶放入 5%CO2、37孵箱中培养 2 h 后轻轻将瓶底翻转向下，继续培养 5 7 d，观察细胞生长情况，酌情换液。(为避免组织块脱落要轻拿轻放)细胞长满后可除去组织块，用胰蛋白酶消化离心法收集细胞，传代培养。（此法较难）-人骨髓源性成骨细胞体外培养和生物学特性的研究 人骨髓梯度离心法提取成骨细胞和破骨细胞