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1、第一章绪 论1、主要内容：讲述细胞培养的基本概念、细胞培养的优缺点及细胞培养的发展史2、目的要求：通过本章的学习，使学生掌握细胞培养的基本概念、细胞培养的优缺点，了解细胞培养的发展史。3、本章重点：1.细胞培养的基本概念。2.细胞培养的优缺点。4、本章难点：细胞培养的发展史5、教学方法：现场教学和多媒体相结合6、教具：图片、多媒体课件。一 细胞培养的概念Cell culture(细胞培养)：细胞（包括单个细胞）在体外条件下的生长，称为细胞培养。实验室口语中，人们常将它扩展至组织培养与器官培养。(国际组织培养协会）组织培养的概念组织培养（TissueCulture）其本意是指从体内取出组织和细胞
2、，摹拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。器官培养（OrganCulture）,指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法，以上三个层次的培养，又可统称之为体外培养（InVitro）。细胞培养体外培养组织培养器官培养二 对组织培养的评价：优点能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动。便于使用摄影、摄电影和闭路电视等方法进行记录，直接观察活细胞变化。可供研究的细胞种类极其广泛。便于使用各种不同的技术方法观察和研究细胞。（爬片）培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组（Gen
3、ome），是分子生物学和基因工程学的研究对象。易于施用物理、化学和生物因素等进行实验研究。（紫外线、药物）可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，比较经济。已成为生物制品、单克隆抗体生产和基因工程制品等的生产手段。二 对组织培养的评价：缺点组织细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，尽管模拟体内技术发展很快，但与体内环境相比，仍有很大差异。三组织培养的诞生和发展简史组织和细胞研究经历了四个世纪；组织培养的发展经历近百年。最早证明动物组织培养为一种有用的实验技术是在 1907 年三组织培养的诞生和发展简史两种不同的观点：1.原始的胚胎神经元或神经细胞的细胞质向外突起而形成轴突。2.连贯的链
4、细胞融合便形成了轴突三组织培养的诞生和发展.Harrison 根据他的研究结果，认为 His 和 Cajal 的假说可能是正确。设计出一种能在生活状态下直接观察正在生长的神经末端的方法.Harrison 首先解剖出蛙胚原始脊髓节段哈里森悬滴培养法。建立起一套合理的无菌操作技术。（淋巴）物学知识的研究做出十分重要贡献.一般皆公认 Harrison 为“组织培养之父”，凹玻片悬滴制备培养技术，对生年 Wilhelm Roux 把鸡胚组织培养于温盐水中，存活了几天。此外Arrold 于 1885 年，jolly 于 1993 年曾把青蛙和蝾螈的白细胞输注于生理盐水或血清中，观察到活细胞的运动三组织培
5、养的诞生和发展1885美国医生 M.T.Burrows，他 Harrison 实验室工作了数月，学习了这种技术，用鸡血浆代替淋巴。用胚胎浸出液和血浆混合Carrel 反复传代的方法使细胞系存活flask）三组织培养的诞生和发展34 年。发明的卡氏培养瓶（Carrel人工合成培养基，无血清培养基的发展器官培养的发展应用国际组织培养协会统一规定的专业术语1Cell culture(细胞培养)：细胞（包括单个细胞）在体外条件下的生长，称为细胞培养。在实验室口语中，人们常将它扩展至组织培养与器官培养。2.Cell generation time(细胞一代时间)单个细胞两次连续分裂的时间间隔。3Cell
6、 strain(细胞株):通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物.4population doubling time（群体倍增时间）:在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需的时间。5Passage(传代或传代培养)不论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。该词与 subculture同义6Clone(克隆)：单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，它们的遗传特性相同。7.Cell line（细胞系）原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。如果不能继续传代或传代数有限,可称为有限细胞系（finite cell lin
7、e），如可连续传代，则可称为连续细胞系(continuous cell line),即“已建成的细胞系”（established cellline）8Primaryculture(原代培养)：从体内取出细胞或组织的第一次培养9.Anchorage-dependent（贴壁依赖性）为细胞需贴附于底物或支撑物上才能生长的性质。10.细胞杂交(cell hybridization):两个或多个不同的细胞融合,导致一个含核体的形成.课后作业1.理解并掌握十个专业术语的意义。2.细胞培养的优点3.试述 Harrison 和 Carrel 在组织培养的发展史上所作的重大贡献。第二章培养物的生长生物学1、主
8、要内容：讲述体外细胞培养物的生长类型、体外培养物的细胞生物学特点以及影响体外细胞生长的几个因素2、目的要求：通过本章的学习，使学生掌握体外细胞培养物的生长类型、影响体外细胞生长的几个因素，熟悉体外培养物的细胞生物学特点。3、本章重点：1.体外细胞培养物的生长类型。2.影响体外细胞生长的几个因素。4、本章难点：体外培养物的细胞生物学特点5、教学方法：理论讲授和多媒体相结合6、教具：图片、多媒体课件。说明：1.本章共分 3 节。以教师讲授,图片展示相结合，以利于学生理解解。引言:培养物生长生物学特征具有两重性：1.基本生物学特征与体内的细胞相似。2.生长环境改变，失去了在体时有机体整体的生长调节机
9、制。第一节体外细胞培养物的生长类型先综合讲解分类,再逐类讲解按生长方式分两大类1.黏附型(上皮型细胞,成纤维型细胞,游走型细胞多形型细胞)2.悬浮型基本概念黏附型细胞也称锚着依存性细胞（anchorage-dependent cells）是指由它们繁衍出来的细胞只有贴附于不起化学作用的物体表面时，才能生长，生存或维持其功能的细胞悬浮型细胞则是不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞1、黏附型细胞按照培养细胞的主要形态，可将其分为几大类型：上皮型细胞成纤维型细胞游走型细胞多形型细胞1.1 上皮型细胞主要形态学特征：扁平，形态较为规整，呈多角形，胞体近中央处有扁圆的细胞核；细胞之间相
10、互衔接或呈镶嵌状紧密排列，呈现“铺路石样”。上皮型细胞的起源内胚层与外胚层的细胞，都可能呈现上皮型。（神经细胞起源于外胚层，培养时呈现多形型）。观察几种成纤维细胞的图片1.1.3 体外培养的大鼠胸膜间皮细胞图片 1304 细胞株（脐带内皮细胞）图片 2304 细胞株（脐带内皮细胞）1.2 成纤维型细胞胞体大致呈梭形或不规则形。主要形态学特征是：细胞呈梭形、长条形、多角形或不规则形。多数情况下，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。也见相互平行排列，呈现放射状、漩涡状等走行成纤维型细胞的起源:中胚层的细胞图片展示人羊水细胞传代培养物，示成纤维型细胞成纤维型细胞（人成纤维母细胞株）小鼠脑细胞培养(fi
11、broblast-like cell)。1.3 游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。形态学特征：细胞相互分开；常具有胞质突起(伪足)。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维型的细胞。游走型细胞来源具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞。在植块培养时，这类细胞最先从植块迁移出来。1.4 多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形。体外培养中最常见的是神经元和神经胶质细胞图片展示体外培养的大鼠大脑皮质少突胶质细胞，示多形型细胞脐血中单个核细胞诱导分化后状态第二节体外培养物的细胞生物学特点一|培养细胞分化状态的变化1.脊椎动物发育基本过程2.
12、去分化或脱分化：有机体的细胞置于体外环境中培养时，原本各种各样的分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能个性，表现出某种趋向性。3.体外培养的环境细胞结构与功能上的可塑性很大4.防止细胞去分化的措施:提高接种的细胞密度(高于 105个/cm2)提高钙离子浓度(300-1500mol/L)使用诱导分化的激素(如氢化可的松)与/或生长因子5.防止细胞分化,促进细胞增殖的措施:低密度生长,低钙离子浓度(仅 100-600 mol/L)加入细胞生长因子(如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板来源的生长因子自发转化(transformation)细胞特征:然发生核型改变;转化细胞的性状可随着细胞分裂传递给
13、子代细胞.二.培养细胞的增殖能力体外培养细胞的两大生命特征:分裂增殖和生长发育三体外培养细胞的生长过程从总的过程讲,整个生命活动可分为:原(初)代培养期传(继)代培养期衰退期体外培养细胞的整个生命活动过程分期原代培养期概念:从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期.一般为 1-4 周原代培养期特征:完成过渡和适应过程,恢复分裂增殖和生长发育能力.细胞呈现 异质性(heterogeneous)细胞的结构和功能最接近在体时情况.原代培养期细胞主要生长生物学行为:1 黏附和贴壁1).黏附(adherence)是细胞培养能否成功的第一步。细胞与固相表面亲和性的大小，主要与细胞表面及固
14、相表面所带的电荷性质和量有关。2)贴壁(attachment)与黏附只是程度上的不同。黏附的细胞通过少数接触点与生长表面结合，贴壁的细胞以整个接触面与生长表面牢靠结合。不同细胞的黏附能力不同。在数分钟至数十分钟内黏附到固相表面,数小时乃至更长的时间才能黏附到固相表面.影响细胞黏附和贴壁的因素1.培养液的温度,低温妨碍黏附和贴壁的速度2.降低培养液的悬浮力3.培养液中的离子成分及其浓度4.培养器皿表面包被某些生物活性物质促进细胞黏附如胶原、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、层黏连蛋白、纤维连接蛋白等.2.铺展(spread)进行生命活动的基本的生长特点或生长行为.描述铺展状况的两个参数:培养细胞的面积大小
15、(测微尺)培养细胞的高度(细胞在垂直方向上的厚度)聚焦时微调旋扭刻度值的变化程度铺展的过程1.圆形变成圆饼形(放射状铺展细胞)2.扁平的极性细胞细胞的贴壁延展过程3.细胞运动4.细胞分裂传代培养期细胞质周边部分伸出的伪足有关(丝状和片状)不同细胞分裂增殖活动恢复得快慢不同细胞铺展的越好,细胞越扁,DNA 合成率越高概念指由首次传代开始经反复传代一直到培养物开始衰退之前的全部时间特点:1、历时时间长 2、细胞分裂增殖活动旺盛,细胞生长活跃.3、细胞逐渐进入去分化状态 4、增殖能力较强的细胞处于优势 5、细胞发生转化的概率增大每传一代细胞的生长过程分为:潜伏期;指数生长期;停滞期传代培养期1.潜伏
16、期（latent phase）指细胞对传代操作所致损伤的恢复期和对新的环境的适应期影响潜伏期长短的因素1.细胞种类2.接种的细胞密度3培养条件;传代时间是否合适2.指数生长期又称对数生长期(logarithmic growth phase)细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段，细胞数量呈指数增长。判断细胞生长是否旺盛的指标1.有丝分裂指数（mototic index MI）培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比。0.1-0.5%3-5%2.细胞群体倍增时间3.MTT 法（酶活性）4.3H-TdR 掺入法（DNA 合成快慢）接触抑制(contact inhibition):细胞相互接触连接成片时,
17、表现出由于接触而相互抑制的特征.3.停滞期(stagnate phase)也称平台期(plateau phase)衰退期向前发展,只有退化死亡四植块培养物的生长生物学生长过程：培养 1-3 天后细胞向外迁移;移出的细胞不断分裂增殖，在植块周围形成一圈细胞。第三节 影响动物细胞体外生长的因素一营养成分和生长基质二温度条件对细胞的影响三、气相环境对细胞生长的影响四、培养液的酸碱度对细胞生长的影响五、辐射线对细胞生长的影响六超声波对细胞生长的影响七影响细胞生长的其他因素本章作业第三章组织培养设施和基本条件目的要求：通过本章的学习，使学生掌握实验室设计要求，建立细胞培养实验室常用的设备器材及实验室器材
18、的使用方法。本章重点：1.常用几种大型仪器的工作原理及使用注意事项。2.实验室器材的处理方法。本章难点：1.倒置显微镜、CO2 培养箱的工作原理及使用注意事项。说明：1.本章共分 3 节。以现场教学、教师演示、学生实验相结合，针对实验室的多种设计方案，建立细胞培养实验室常用的大型设备器材运用实物及多媒体教学的方式向学生展示，以利于学生理解解；直接向学生演示特殊器材的使用装方法，以增强学生对实际操作的理解。教具：不锈钢筒式滤器，混合摇匀器，磁力搅拌器，第一节实验室的设计污染问题是威胁细胞培养的主要问题，如何避免污染是细胞培养成功的关键。因些实验室的设施主要是为避免污染而设制的。细胞培养工作室大致
19、可以分为如下几个功能区：无菌操作；温育；培养液的配制；洗刷；无菌处理；细胞和用品的贮存实验室设计要求：准备室，缓冲间，无菌室，传递仓。简述影响动物细胞生长的因素试述温度对细胞生长产生的影响掌握体外细胞培养物的生长类型。防止细胞去分化的措施。简述体外培养细胞的整个生命活动过程。简述每一代细胞的生长过程分期。附：图片展示第二节建立细胞培养实验室的设备器材介绍大型工具类、消毒灭菌类、配液用具制备细胞用品类。重点以大型工具类为主，讲解几种常用大型工具使用方法及注意事项净化工作台现场教学原理使用方法注意事项CO2 培养箱（重点）结构与工作原理。使用方法注意事项。双蒸器（重点）现场教学工作原理。使用方法。
20、注意事项。倒置显微镜（重点）现场教学结构，原理使用方法注意事项二、消毒灭菌类三、配液用具四、制备细胞用品练习与测试常用消毒灭菌类器材有那些？倒置显微镜使用方法及注意事项？常用的配液用具？双蒸器的使用方法及注意事项？本章详细内容第一节细胞培养实验室的设计一、介绍细胞培养实验室设计不当的实例，增加学生对细胞培养实验室重要性的认识。二、讲授细胞实验室的各个功能分区划分及管理。概述：组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。各部门最好分别设置于相连的各个房间，特
21、别是无菌操作室最好能单独设置；如都安置在一大实验室内。无菌操作区与清洗、消毒灭菌区应分别位于两端、而制备、储藏和孵育区位于此两区之间。（一）无菌操作区无菌操作区是只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离不能穿行或受其他干扰。无菌操作室应划分为更衣间、缓冲间、传递仓及操作间三部分。1、更衣间：供更换衣服、鞋子及穿就帽子和口罩。缓冲间位于更夜间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境。同时可放置恒温培养箱及某些必须的小型仪器（如冰箱、离心机等）。2、缓冲间：3、无菌操作间：专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当且其顶部不宜过高以保证紫外线的有的灭菌效果；墙壁光滑无死角。以便清洗和消
22、毒。工作台安置不应紧靠墙壁台面以光滑的压塑作表面漆成白区或灰色以利于解剖组织及酚红显示 pH 的观察。无菌操作间为密闭式，一般无菌操作间的空气消毒用紫外线灯紫外线可产生臭氧，并且室内温度及湿度均较高不利于工作人员健康 故最好应设置空气过滤的恒温恒湿装置。有些实验室使用无臭氧紫外线消毒器或电子消毒灭菌器。电子消毒灭菌器在高压电场作用下，电子管的内外电极发生强烈电子轰击。使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧是一种强氧化剂、能同细菌的胞膜及酶蛋白的硫基进行氧化分解反应 从而靠臭氧气体弥漫性扩散达到杀菌之目的，消毒时没有死角。消毒后空间内的残留臭氧只需 30 一 40min即能自行还原成氧气对空间
23、不留异味，消毒物体表面不留残毒。（二）、孵育区本区对无菌的要求虽不如无菌区那样严格 但仍需清洁而无灰尘，因此也应在干扰少且非来往穿行的区域。孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行、后者费用较高一般实验室多采用孵箱中进行。（三）、制备区制备区主要进行培养液及有关培养用液体等的制备。在有天平、PH 计、磁力搅拌器等设备下完成制备以后应在无菌操作下进行过滤除菌。液体制备直接关系组织细胞培养的成败因此必须严格无菌操作。（四）、储藏区储藏区的要求是取放方便，主要有冰箱、干燥箱、液氮罐、细胞培养液、培养瓶等、此环境也需要清洁、无灰尘。（五）、清洗和消毒灭菌区清洗和消毒灭菌区应与其它区分开，主要进行所有细胞培
24、养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等的工作第二节 建立细胞培养实验室的设备器材净化工作台（一）、概述：目前大多数从事培养工作的实验室都已装备了超净(净化)工作台。这种工作台操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好，为培养工作提供了良好的无菌操作环境。即使在不装备单独的无菌操作间的情况下，只要安装了超净工作台，也能基本上满足简单的细胞培养工作的需要。现在国内的净化设备厂已能生产各种级别和档次的净化工作台，但一般细胞培养室多利用两种净化工作台。一种是侧流式或称为垂直式；另一种为外流式或称为水平层流式。（二）、基本原理：空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出
25、的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同，侧流式工作台空气净化后的气流由左或右侧通过工作台面流向对侧，也有从上向下或从下向上流向对侧，都能形成气流屏障保持工作区无菌。但在净化气流和外边气体交界处可因气流的流动出现负压，使少许未净化气体混入，有发生污染的可能。侧流式净化台结构较为封闭一般仅留两个子臂伸入的圆洞，操作和拿取较大物品不够方便。外流式(水平式)是使净化后的空气面向操作者流动，因而外方气流不致混入操作区，但如进行有害物质实验操作则对操作工作者不利。水平式净化工作台工作多为开放式，没有防护挡板，虽然操作和拿取物品较为方便，但
26、可能受外界气流流动的影响而引起不洁空气混入。（三）注意事项：1、净化台宜安置在清洁房间（无菌室）内，防止尘土阻塞滤器，缩短高效滤器使用寿命，降低净化效果。2、必须经常注意工作区上方微压表的指示。一旦感到气流变弱，如酒精灯火焰不动，加大电机电压也不见情况改变则说明滤器已被阻塞、应及时更换。一般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高效滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。要定期将粗过滤器中的过滤布拆下清洗，时间应根据环境洁净程度而定，通常间隔36 个月进行次。根据净化台周围环境的洁净程度，定期(23个月)将粗涤纶滤布清洗或更换。3、新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸
27、尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。4、定期(一般 1 周)对环境迸行清扫和灭菌工作。经常用沾有酒精或丙酮等有机溶剂的纱布擦拭紫外线杀菌灯表面，保持其表面清洁，否则影响杀菌效果。5、每次使用工作台时，应先用 75酒精擦洗台面，并提前以 30 一 50min紫外线灭菌灯。在关闭灭菌灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。6、净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰。7、每次使用净化台后要及时清除工作台面上的物品，并用酒精擦洗台面使之始终保持洁净。二、水纯化装置(自动双重纯水蒸馏器)（一）概述：细胞培养对水的质量要求很高，所用
28、的水必须事先纯化处理。水纯化时可采用离子交换纯水装置或蒸馏器。离子交换纯水时，尚不能有效去除有机物，因此用水时尚需再蒸馏。进行细胞培养时，配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水；即使用于玻璃器皿的冲洗，至少也应是二次蒸馏水。目前国内使用较多的有自动双重纯水蒸馏器(石英管加热)，使用时方便、安全、蒸馏速度快。但使用这种蒸馏器必须注意维护，不可采用普通自来水蒸馏，以免蒸馏器内很快结满水垢。正确的使用方法是将经金属蒸馏器蒸馏的蒸馏水加入玻璃蒸馏器内进行蒸馏。一般配制培养液化的用水应在配液前蒸馏，不宜使用存放数日的三蒸水，以免影响培养用水的质量。（二）、使用方法A、打开蒸馏贮水瓶活塞，水通过水位器2
29、 而流人烧瓶 8 内，升降水位器的浮子导管，使烧瓶内水位达到正常高度，然后拧紧螺帽。B、打开自来水源，水进入冷凝器。C、接通电源（220 伏，11A)，开始蒸馏。调节冷却水源流量，使水位器溢出的冷却水保持在 40-45，但不得有蒸汽出现。D、蒸馏半小时后,应检查热继电器 5 的保护作用，其方法是：切断水源，蒸汽从冷却器下端的出气口大量喷出，23 分钟继电器电源切断，从而起到保护作用。电源切断后，立即打开自来水源，待 35 分钟热继电器冷却到室温时，用手掀一下 522 继电器箱上掀钮；电源立即接通；掀钮恢复红色，继续蒸馏。有时由于热继电器位置不当，会无故切断电源，这时只需将热继电器转一角度即可。
30、（三）、注意事项（l）使用前先开水源，后通电源。使用完毕先关电源，后断水源。（2）为防止 522 继电器失灵，在蒸馏前将后继电器与前位加热器间的电源切断，当一蒸水高于后加热管5 厘米时，接通已切断的电源；二次蒸馏开始。这样操作比较安全。3）最好用金属蒸馏器生产的蒸馏水或去离了水作蒸馏水水源,若用自来水作水源，玻璃烧瓶内很快积满水垢。若烧瓶内水垢产生，需及时清洗，否则影响蒸馏效果，严重时会损坏加热器。清洗方法：移下冷却管，但不需拆下胶管；小心加入 l00 毫升浓盐酸到横式烧瓶内，瓶内水将其稀释成稀盐酸，与水垢作用成可溶性化合物，数分钟后由水位器放掉，再用自未水冲洗数次。为了清除微量的盐酸可将烧瓶
31、前后摇动，螺帽重新调节，清洗死角，直至清洁为止。洗后首次蒸馏时，开始 10 分钟内蒸馏水应弃去不用。（4）在蒸馏时不断补充水，以免因断水烧坏仪器。（5）每次蒸馏时间不要超过 3 小时（6）通过高速放水活塞来试验浮子的灵敏度，观察其是否能拉制水位,并且要重复几次。三、压力蒸汽消毒器（一）概述手提式压力消毒器适合一般实验室使用。浸人式电热压力蒸汽消毒器，消毒前锅内加水 3.5 一 4 升，通过电热管使水升温，加压消毒。（二）注意事项（1）使用压力蒸汽消毒器时，千万不要忘记加水，水按要求量加入，水太多会使消毒包装物过于潮湿；水太少消毒时间未到水已蒸发尽会损坏电热器和消毒器身。如果压力表指针下降说明加
32、热器内水已不多或蒸发尽。（2）必须放气：两种方式，开始加热时就 打开放气阀至热气喷出。110再放气。四、电热恒温干燥箱：（一）、概述电热恒温干燥箱主要用于烘干和干热消毒玻璃器皿。带鼓风机的干燥箱升温较慢，但温度均匀。（二）注意事项：（1）电源接通，鼓风与升温同时开始，待达到所需温度时，停止鼓风。禁止先升温后鼓风，因为温度较高，鼓风使新鲜空气进入，造成局部高温，有时会起火，也可使消毒的玻璃器皿破裂。（2）干燥箱的散热板不能放置物品，以免影响热空气对流。（3）箱内的物品不宜过挤，以利于冷热空气对流。（4）物品放入箱内以后，将箱顶部的孔打开，以利于箱内潮湿空气外流。（5）湿热消毒后，物品选择 50烤
33、干。（6）为防止电热恒温干燥箱调节器失灵，离开实验室时要切断电源。五、电热恒温培养箱（一）、概述：体外培养的细胞和体内细胞一样，都需要在恒定的温度下才能生存，大多数情况下，最适温度是 37，温差变化一般不应超过土 05。细胞在温度升高 2时，持续数小时即不能耐受，40以上将很快死亡。因此要求培养箱灵敏度高，温度较稳定。如生化恒温培养箱及 C02 培养箱，具有较高的灵敏度。一般实验室最好能有两个培养箱，以便万一出现问题可以替换使用而不影响工作。（二）、注意事项：1、箱内物品不宜过挤保侍热空气畅通流动和箱内平均受热。2、箱内底板因接近电热器，不宜放置实验物品。3、使用时箱的风顶适当旋开，使潮湿空气
34、外逸。箱内温度中层和上层可相差 0.3 一 0.54、隔水式电热恒温培养箱使用前需加温蒸馏水至浮标指示“止水”为止。六、CO2 培养箱（一）、概述：现在，多数的细胞培养实验室已使用CO2 孵箱。其优点是恒定的提供所需要的一定量的 CO2(常用为 5CO2)，使培养液的 pH 保持稳定，适用于开放或半开放培养。培养细胞的器皿可用培养皿、培养板或培养瓶；由于这种培养方法培养器皿内部与外界相通。因此培养箱内空气必须保持清洁，定期以紫外线灯或酒精擦拭消毒。同时尚需保持箱内的相对湿度为 l00，防止培养液蒸发，箱内要放置内为无菌蒸馏水的水槽。（二）、注意事项1、用螺旋口瓶培养细胞时需将瓶盖微松，以保证通
35、气。但瓶口过松，易污染。2、保持CO2 培养箱内空气干净。定期用紫外线灯消毒，或用酒精纱布擦拭后，再用无菌干纱布擦于。3、箱内水槽中加 13 l2 体的灭菌蒸馏水（1000 毫升蒸馏水中加新洁尔灭 5 毫升），以维持箱内湿度，避免培养液蒸发。4、取放培养物时，可将培养瓶皿置于带盖搪瓷盘或饭盒内，缩短开箱的时间，减少 CO2 消耗。搪瓷盘入箱前，盘外壁要先用酒精纱布擦拭，再用无菌干纱布擦干，以减少微生物带入箱内。练习与测试常用消毒灭菌类器材有那些？双蒸器的使用方法及注意事项？第四章清洗、包装、清毒1、主要内容：讲述细胞培养用品的清洗、包装和消毒方法2、目的要求：通过本章的学习，使学生掌握细胞培养
36、用品的清洗、包装和消毒方法3、本章重点：细胞培养用品的清洗、包装和消毒方法4、本章难点：大滤器的安装、使用和拆除方法及操作注意事项。5、教学方法：现场教学和多媒体相结合6、教具：无菌操作台等实验器材、多媒体课件。一、纯净水制备高度净化水的制备是器皿清洗和准备各种培养用液时的先行工作。（一）蒸馏水贮放时间太长久可能引起的情况：1电阻水平下降为 0.61.0，2贮藏瓶壁上溶解下来的杂质会混入其中，如来自塑料瓶的有机物质或来自玻璃的离子等。3大气中离子类或大分子类（微生物类的内毒素）物质溶解其中。4大气的 CO2溶解（二）纯化水制备应注意事项：1在准备室选择一处洁净、无尘、清静的地方放置纯化水的装置
37、。2所得的纯化水贮备在专用的干净玻璃瓶内，最好用硼砂硅玻璃瓶内，标记上制备的日期。（三）纯化水的常用制备方法1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合水中含有溶解或不溶解的矿物盐、油脂及酸类，以及 O2,CO2,H2S,Cl2等。这些物质通过离子交换树脂除去。采用阳离子树脂或阴离子树脂处理。常使用强酸性阳离子交换树脂和强碱基性阴离子交换树脂，将水流通过离子交换柱即得纯，净的去离子水。去离子水再经过双重蒸馏器蒸馏得纯化水，用于配制溶液。2.超纯水装置制备纯化水二、清洗和包装新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，使其不含任何残留物。因不同培养器皿的材料、结构、使用方法不同，清洗的方法也有区别，现分别介绍
38、如下：（一）玻璃器皿类的清洗需注意的事项：1用过的玻璃器皿，应立即浸泡在清水或消毒水中。2挑选一种合适的去污剂3必须用自来水冲洗干净，再用去离子水或重蒸馏水漂洗；4洗过的玻璃器皿作倒立式凉干或烘干；5用牛皮纸或锡箔包装后，放置干净无尘处，待消毒。（二）玻璃器皿的清洗步骤1.浸泡目的：软化和溶解附着物。新的玻璃器皿：自来水简单刷洗，然后 5%盐酸浸泡过夜。用过的玻璃器皿：往往附有大量蛋白质和油脂，用后应立即浸入清水中备刷洗。2.刷洗放在含洗涤剂的水中，反复刷洗。刷洗中注意事项：（1）要不留死角。（2）防止破坏器皿表面的光洁度。（3）应使用软毛刷3.浸酸浸酸是将玻璃器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通
39、过清洁液的强氧化作用清除器皿表面可能残留的物质。根据清洁液含硫酸比例，将清洁液分为强酸、次强酸和弱酸三种。根据需要配制、选用不同的清洁液。清洁液对玻璃无腐蚀作用，去污效果很好，是保证器皿洁净的关键一环。一般来说，新的或用过的玻璃器皿都应浸酸，那些无法用毛刷刷洗的用品（如吸管、滴管等）更要靠浸酸去除污物。浸酸时应注意事项：1器皿应完全被清洁液充满和覆盖。2浸酸时间不能少于 6 小时，一般要过夜或更长时间。3将器皿放入清洁液时，应小心操作，防止伤及皮肤、眼睛或衣服。4从清洁液中取出器皿时，应沥干清洁液，并将浸酸的器皿放入合适容器，如塑料盆中运输。5用于浸酸的物品应提前凉干配制清洁液的方法：（1）选
40、用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。（2）按配方称量好重铬酸钾和蒸馏水，然后将重铬酸钾完全溶于蒸馏水中。（用玻棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）。（3）缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将产热而发生危险（绝不可将重铬酸钾液倒入浓硫酸中）。（4）自然冷却、备用。清洁液配置和使用过程中应注意事项：1）配置时应戴口罩，防护衣和长的耐酸手套。2）应严格按操作方法进行3）若清洁液的颜色变暗、发绿或混浊时，应弃去（深埋地下），配制新的。新配制的清洁液呈棕红色。4）配制、盛装清洁液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。一般定做专用耐酸缸。4.冲洗冲洗可用洗涤装置，也可用手工操作。手工洗涤
41、浸酸后的器皿时，每件器皿都至少要重复“注满水-倒空”20 次以上，最后用重蒸水浸洗 23 次，晾干或烘干后包装备用。（二）螺旋盖的清洗和包装常用内衬以合成的橡皮或矽垫的铅制盖和聚丙烯盖。1.铅盖去污剂浸泡 15 分钟自来水冲洗多次去离子水浸泡过夜去离子水冲洗：三蒸水冲洗注意（1）铝制品在碱性的去污剂中不能超过 30 分钟（2）不可用浸泡过铝制品的去污剂浸泡玻璃器皿。2.聚丙烯盖矽硅塞子这种盖和塞子应按铝盖的方法浸洗。包装：清洗干净的盖子放在大培养皿内，盖子开口向下，用软纸包扎或用蒸气可透入的尼龙膜（Portex）包装。（三）橡皮帽和橡皮塞的清洗新的橡皮帽和橡皮塞在 2%NaOH（约 0.5mo
42、l/L）溶液中浸泡过夜或煮沸处理15 分钟，用自来水冲洗；再用2%5%HCl 浸泡 30 分钟。再用自来水冲洗；最后用去离子水浸泡过夜再冲洗后烘干。用过的橡皮帽、橡皮塞则用沸水处理，清水漂洗，去离子水冲洗、烘干即可。（四）橡皮管的清洗新的橡皮管的清洗步骤同橡皮塞的清洗步骤。为了保证橡胶皮管内的清洗，可用注射器反复吸或放洗涤剂的方法进行冲洗。接在热水管上用热水冲洗去污剂，用去离子水冲洗后烘干。用过的橡皮管则用热水冲洗，去离子水冲洗、烘干。（五）塑料制品的清洗塑料制品的特点是：质地软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。其清洗程序为：使用器皿后立即用流水冲洗浸于自来水中过夜用纱布或棉签和50洗涤液
43、刷洗流水冲洗晾干浸于清洁液中15分钟流水冲洗20遍蒸馏水浸洗三次双蒸水中泡 24 小时晾干备用。（六）不锈钢除菌滤器的清洗清洗涤剂刷洗新的或使用后的滤器流水冲洗 15 分钟去离子水浸泡 24小时三蒸水浸泡 24 小时干燥备用。（七）金属器械的清洗新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最好用酒精棉球擦拭，晾干。用过的金属器械应先用酒精棉球擦拭干净，再煮沸或高压消毒以备下次使用。(八)注射器薄膜滤器由塑料制成，分下、下两部分，上部分接注射器，下部分接滤过无菌瓶。洗刷时先将上下两部分松开，注意垫圈和垫片摆放的位置。处理同塑料器皿，晾干后将纤维薄膜滤片夹在中间（光面向下
44、）拧紧上下两部分，摆放于金属盒内或单独包装，高压灭菌后备用。（九）G6除菌滤器的清洗新的滤器清洗：将玻璃除菌滤器置玻璃滤器洗液（配制方法：取 10g 硝酸钠溶于盛有 470ml 蒸馏水的玻璃缸内，加入 28.6ml 浓硫酸混匀备用）中浸泡 24小时流水缓慢冲洗至pH5.5左右用4倍体积的蒸馏水缓慢冲洗再用重蒸水缓慢冲洗烤干包装、消毒，备用。用过的滤器清洗：用过玻璃除菌滤器后，立即浸泡于水中（注意：千万不能使滤器干涸）过夜，流水缓慢冲洗 24 小时或更长时间，至滤面基本疏通时，50烤干，滤器再置于清洁液中浸泡 24 小时，或装满清洁液自然过滤。流水冲洗及其后的处理同新的玻璃除菌滤器。（十一）去污
45、剂的选择要根据实验要求选择去污剂。肥皂水较常用，肥皂水有助于润湿器皿，对不可混合的液体能起乳化剂的作用，对固体物质起着离散作用。缺点是易与Ca2+和 Mg2+以及硬水中的金属离子形成不易溶解的螯和物。碱性去污剂和含有重铬酸钾的硫酸普遍被采用。将玻璃器皿先浸于肥皂水，冲掉肥皂水后，再浸于硫酸洗液中过夜.二、包装包装的目的是防止消毒灭菌后再次遭受污染，所以经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再行消毒灭菌处理。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。包装分为局部包装和全包装两类，前者用于较大瓶皿，一般用硫酸纸和牛皮纸将瓶口包扎好；后者适于较小培养瓶皿、吸管、注射
46、器、金属器械和胶塞等，以下为常用瓶皿、吸管、无菌衣帽等的包装方法，其它物品可参照处理。1.瓶类：硫酸纸罩以瓶口，外罩二层牛皮纸用绳扎紧。2.小瓶皿、胶塞、刀剪等器械可先单独用单层牛皮纸包装，再将同时使用的物品用双层牛皮纸包装到一块，用绳扎紧；也可将这些器械直接装入消毒盒内，消毒时打开排气孔，消毒后再关上备用。3.吸管、滴管口用脱脂棉塞上（不要太紧或太松）装入消毒筒内或单独包装，滤器、滤瓶、橡皮管等都要用牛皮纸包好口，外罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。4.无菌衣、帽、口罩，均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。三、消毒和灭菌目前，多采用物理方法和化学方法消毒灭菌，抗生素也是一种重要的灭菌手段，实践中需根
47、据消毒灭菌的物品不同而选择合适的消毒方法。（一）物理消毒法1.紫外线消毒革兰阴性菌最为敏感，其次是革兰阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。2.紫外线的直接作用机制是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。3.紫外线的消毒同紫外线的辐射强度和照射剂量呈正相关紫外灯照射还受其他环境条件，如室温和湿度、空气清洁度、遮挡物、染菌量、紫外灯管的老化程度等影响。紫外线不仅对皮肤、眼睛有伤害，而且对培养细胞与试剂等也产生不良影响。2.电离辐射灭菌电离辐射灭菌是以放射性核素产生的射线电离辐射灭菌或电子加速器产生的加速离子辐射物品以杀灭微生物的方法.射线由放
48、射性核素60Co 产生，加速粒子由电子加速器产生，两者均可对金属、塑料、橡胶、玻璃、陶瓷、人工医学制品等进行灭菌。3.高温湿热灭菌压力蒸气灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。高温高压蒸气对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、衣物、玻璃器皿、金属器械、胶塞和某些培养用液等都可用这一方法灭菌。4.高温干热灭菌干热灭菌主要是将电热烤箱的物品室加热到 160以上，并保持 90-120 分钟。这种消毒法仅限用于一些不能直接与蒸气接触的物品，或不至于被高温损坏的物品。5.过滤除菌过滤消毒大多用于遇热不稳定的试剂或培养液。根据液体性质，流速，含颗粒大小和除菌的要求而选择过滤方式。（
49、3）比较正压与负压过滤除菌正压过滤优点：1）流速高，过滤快；2）如不发生向外溢漏，可减少污染；3）可将需过滤的液体直接滤到储存瓶内，不需要缓冲瓶，不会出现由于真空泵倒流而造成的污染；4）过滤蛋白质时可避免产生大量气泡；5）有利过滤沸点低的试剂。（4）过滤系统的设计和选择 1）正压过滤系统的程序：首先选择合适体积的滤器，参见表 4-9，放好固定滤器的支架，将消毒部分和不消毒部分装配成一套正压过滤系统，如图 4-3 所示；图4-3正压过滤系统图解真空泵，提供正压通过高压管将压力贮于压力容器瓶内，瓶内放有待过滤的液体液体通过装有 0.2m 滤膜的圆盘过滤装置过滤滤过的液体流入消毒接收瓶内分装入消毒盐
50、水瓶内，加盖，贮存备用。将预备过滤的培养液等液体倒入压力容器瓶内；将水泵打开，给予100kPa 的压力，使培养液等通过滤膜过除菌，滤液导入消毒接收瓶内；通过接收器出口，将消毒的液体分装入培养液贮存瓶内，加盖，贮存备用。2）负压过滤系统程序：（二）化学消毒法化学消毒是利用化学消毒剂来消毒那些不能用物理消毒等方法进行消毒的物品和场地，如无菌室的空气、台面、操作者的皮肤等。细胞培养中常用的化学消毒剂包括甲醛、环氧乙烷、乙醇、氯已定（洗必泰）、戊二醛、碘伏和碘酊、乳酸、来苏尔等。此外，市场上以各种商品名所称的化学消毒剂多为复合类制剂，可用台面、地面等的消毒，使用时按说明书进行。1.甲醛甲醛（methy