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1、第十二章第十二章 层析技术层析技术1 层析技术（chromatography）又称色谱技术、层离技术等，是一组相关技术的总称。层析技术具有分离精度高、设备简单、操作方便等优点，是当前获得高纯度产物最有效的分离纯化技术。根据使用目的不同，层析技术分为制备制备层析技层析技术术和分析分析层析技术层析技术。2主要内容主要内容第一第一节 概述概述第二第二节 吸附吸附层析技析技术第三第三节 凝胶凝胶层析技析技术第四第四节 离子交离子交换层析技析技术第五第五节 亲和和层析技析技术3 当含有被分离物质的料液流过层析柱时，由于层析剂当含有被分离物质的料液流过层析柱时，由于层析剂对各组分的对各组分的阻滞力阻滞力不
2、同而使各组分分离开来（不同而使各组分分离开来（不同组分不同组分在在流动相流动相和和固定相固定相分配不同）。分配不同）。第一节第一节 概概 述述一、基本原理一、基本原理三通阀收集器检测器泵泵流动相料液DCBA层析柱时间（或流出体体积）流出组分浓度A B C D（a）层析系统基本组成）层析系统基本组成（b）分离出组分峰图）分离出组分峰图4二、层析技术分类二、层析技术分类按流动相按流动相-固定相分固定相分F气气-液色谱（液色谱（GLCGLC）F气气-固色谱（固色谱（GSCGSC）F液液-液色谱（液色谱（LLCLLC）F液液-固色谱（固色谱（LSCLSC）按固定相不同分按固定相不同分F柱色谱柱色谱F纸
3、色谱纸色谱F薄层色谱薄层色谱按分离机理不同分按分离机理不同分F吸附色谱吸附色谱F离子交换色谱离子交换色谱F凝胶色谱凝胶色谱F亲和层析亲和层析F疏水层析疏水层析5三、层析操作过程中一些基本概念和参数三、层析操作过程中一些基本概念和参数料液料液(各组分各组分)层析柱分离层析柱分离随流动相依次流出随流动相依次流出进入检测器进入检测器响应信号响应信号 色谱图的纵坐标纵坐标为检测器的响应信号检测器的响应信号，横坐标横坐标为时间时间或或流动相流出体积流动相流出体积。时间（或流出液体积）流出组分浓度A B C D1.1.色谱流出曲线色谱流出曲线(色谱图色谱图)6色谱图色谱图72.2.体积、时间体积、时间 总
4、柱床体积（总柱床体积（V Vt t）：层析剂经溶胀、装柱、沉降，体：层析剂经溶胀、装柱、沉降，体积稳定后所占据层柱内的总体积。积稳定后所占据层柱内的总体积。外水体积（外水体积（V Vo o）：柱中层析剂颗粒间隙的液相体积的：柱中层析剂颗粒间隙的液相体积的总和。总和。内水体积（内水体积（V Vi i）：溶胀后的层析剂颗粒网孔中的液相：溶胀后的层析剂颗粒网孔中的液相体积的总和。体积的总和。基质体积（基质体积（V Vg g）：干胶体积，是层析剂基质颗粒骨架：干胶体积，是层析剂基质颗粒骨架所占据的体积。所占据的体积。Vt=Vo十十ViVg8洗脱时间洗脱时间(或保留时间或保留时间)()(tete)：从洗
5、脱开始，某一成分：从洗脱开始，某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值(洗洗脱峰最高点脱峰最高点)时的时间。时的时间。洗脱体积洗脱体积(VeVe)：从洗脱开始，某一成分从柱顶部到底部：从洗脱开始，某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值的洗脱液中出现浓度达到最大值(洗脱峰最高点洗脱峰最高点)时的流时的流动相体积。动相体积。9死体积死体积(V Vm m)：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从开始洗脱到柱出口出现浓度最大值时流出的流动相体积。开始洗脱到柱出口出现浓度最大值时流出的流动相体积。其值等于
6、外水体积加内水体积。其值等于外水体积加内水体积。死时间死时间(t tm m)：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从开始洗脱到柱出口出现浓度最大值所需的时间。其值等开始洗脱到柱出口出现浓度最大值所需的时间。其值等于流动相流过层析柱所需的时间。于流动相流过层析柱所需的时间。调整保留时间调整保留时间(t te e t tm m)：保留时间扣除死时间的值。保留时间扣除死时间的值。10峰高峰高(h):(h):色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高。色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高。峰宽峰宽(W)(W)和半峰宽和半峰宽(W(W1/21/2):):峰宽是通过色谱峰
7、的拐点作切线在峰宽是通过色谱峰的拐点作切线在峰底部的截距。半峰宽是洗脱峰高一半时的宽度。峰底部的截距。半峰宽是洗脱峰高一半时的宽度。峰面积峰面积(A):(A):峰与峰底之间的面积称为峰面积。峰与峰底之间的面积称为峰面积。3.3.峰高、峰面积和峰宽峰高、峰面积和峰宽11分离度分离度(R)(R)又称又称分辨率分辨率，是相邻两个洗脱峰保留时间之差，是相邻两个洗脱峰保留时间之差的的2 2倍与色谱峰峰基宽之和的比值，表示式为：倍与色谱峰峰基宽之和的比值，表示式为：R R=2 2（t te2e2t te1e1）（WW1 1+WW2 2）R1R7pH7溶液中才能发生交换反应溶液中才能发生交换反应 羟基树脂在
8、羟基树脂在pH9pH9溶液中才能发生交换反应溶液中才能发生交换反应活性基团：羧基活性基团：羧基COOH，酚羟基，酚羟基OH典型反应：典型反应：RCOOH+NaOH RCOONa+H2O40（3 3）强碱性阴离子交换树脂）强碱性阴离子交换树脂典型反应典型反应：RN（CH3)3OH+NaCl RN（CH3)3Cl+NaOH特特 点点：使用不受：使用不受pH限制。限制。+C2H4OHN CH3 CH3强碱强碱型：型：活性基团：活性基团：+CH3N CH3 CH3强碱强碱型：型：41（4 4）弱碱性阴离子交换树脂）弱碱性阴离子交换树脂活性基团：伯胺基活性基团：伯胺基 NH2 仲氨基仲氨基=NH 叔氨基
9、叔氨基 N等等特点特点：酸性溶液中使用：酸性溶液中使用典型反应典型反应：RNH3OH+HCl RNH3Cl+H2O422.2.大网格离子交换树脂大网格离子交换树脂与凝胶型树脂比较有以下优点：与凝胶型树脂比较有以下优点：交联度高，具有较好的化学和物理稳定性交联度高，具有较好的化学和物理稳定性 孔径大，交换速度快，适合交换有机大分子孔径大，交换速度快，适合交换有机大分子 完全失水也能维持其多孔结构完全失水也能维持其多孔结构永久空隙度，适永久空隙度，适合非水溶液交换合非水溶液交换 在大网格吸附剂上引入离子交换基团在大网格吸附剂上引入离子交换基团433.3.树脂的命名树脂的命名（1)1)标准命名：如标
10、准命名：如00170017 交联度数值交联度数值顺序号顺序号骨架代号骨架代号分类代号分类代号凝胶型树脂凝胶型树脂D 顺序号顺序号骨架代号骨架代号分类代号分类代号大孔型代号大孔型代号大孔型树脂大孔型树脂(2)(2)俗名：如俗名：如732#732#44分类代号分类代号分类名称分类名称0强酸性强酸性1弱酸性弱酸性2强碱性强碱性3弱碱性弱碱性骨架代号骨架代号骨架分类骨架分类0苯乙烯类苯乙烯类1丙烯酸系丙烯酸系2酚醛系酚醛系3环氧系环氧系4乙烯吡啶系乙烯吡啶系5脲醛系脲醛系6氟乙烯系氟乙烯系45(二二)多糖基离子交换剂多糖基离子交换剂 以纤维素、以纤维素、SephadexSephadex、Sepharo
11、seSepharose为骨架或改性后为为骨架或改性后为骨架，连接上离子交换基团后形成。骨架，连接上离子交换基团后形成。有强酸、强碱、弱酸、弱碱四类：有强酸、强碱、弱酸、弱碱四类：二乙胺基乙基（二乙胺基乙基（DEAE）强碱型强碱型季胺乙基（季胺乙基（QAE）强碱型强碱型羧甲基（羧甲基（CM）弱酸型弱酸型磺丙基（磺丙基（SP）强酸型强酸型磺乙基（磺乙基（SE）强酸型强酸型特点：特点：1.1.孔径大，特别适合有机大分子分离孔径大，特别适合有机大分子分离2.2.骨架亲水，电荷密度适中，蛋白质不易变性，骨架亲水，电荷密度适中，蛋白质不易变性，适合蛋白质分离适合蛋白质分离3.3.具有离子交换和分子筛双重功
12、能，分辨率高具有离子交换和分子筛双重功能，分辨率高46三、离子交换剂的理化性能三、离子交换剂的理化性能1.1.颗粒大小：决定流动阻力和交换速度，颗粒大小：决定流动阻力和交换速度，20-6020-60目目2.2.交联度：决定树脂强度和孔径大小交联度：决定树脂强度和孔径大小3.3.含水量：在含水量：在105-110105-110烘至恒重测定含水量烘至恒重测定含水量4.4.膨胀度：充分吸水前后的体积比膨胀度：充分吸水前后的体积比5.5.密度：干真密度、湿真密度、视密度密度：干真密度、湿真密度、视密度 湿真密度湿真密度=树脂湿重树脂湿重/树脂湿颗粒体积树脂湿颗粒体积 (阳树脂湿真密度比阴树脂大阳树脂湿
13、真密度比阴树脂大)视密度视密度=树脂湿重树脂湿重/树脂床体积树脂床体积 视密度用来衡量装柱所需树脂量视密度用来衡量装柱所需树脂量478 8、影响工作交换量因素：、影响工作交换量因素：离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小及离子强度、大小及离子强度、pHpH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。电性质。6 6、化学稳定性：、化学稳定性：阳离子交换树脂用碱处理时，不要与阳离子交换树脂用碱处理时，不要与2mol/L2mol/L以上碱液长期接触，以上碱液长期接触，阴离子树脂则不超
14、过阴离子树脂则不超过1mol/L1mol/L碱液长期接触。碱液长期接触。强碱型树脂稳定性较差，强碱型树脂稳定性较差，OHOH-型树脂在水中不稳定，所以常以型树脂在水中不稳定，所以常以ClCl-型保存。型保存。7 7、交换容量：、交换容量：单位质量干树脂所能吸附的一价离子的毫摩尔数。单位质量干树脂所能吸附的一价离子的毫摩尔数。理论交换容量理论交换容量：又称全交换量、理论交换量：又称全交换量、理论交换量 工作交换容量工作交换容量：将树脂装在柱中，当流出液中目的离子出现时：将树脂装在柱中，当流出液中目的离子出现时（称为漏出点），树脂所吸附的离子量（称为漏出点），树脂所吸附的离子量48四、离子交换剂的
15、选择性四、离子交换剂的选择性离子的水化半径：水化半径越小越易被吸附离子的水化半径：水化半径越小越易被吸附离子化合价：在低浓度水溶液中，离子化合价离子化合价：在低浓度水溶液中，离子化合价越大越易被吸附越大越易被吸附溶液的溶液的pH：影响水解电离：影响水解电离交联度、膨胀度、分子筛交联度、膨胀度、分子筛浓度浓度49五、离子交换层析的操作五、离子交换层析的操作l选择离子交换剂的基质选择离子交换剂的基质1.1.离子交换剂的选择离子交换剂的选择l首先确定是阳离子还是阴离子交换剂首先确定是阳离子还是阴离子交换剂（强酸或强碱型，（强酸或强碱型，还是弱酸或弱碱型？）还是弱酸或弱碱型？）聚苯乙烯聚苯乙烯疏水性较
16、强，分离小分子物质疏水性较强，分离小分子物质亲水性较强的材料：亲水性较强的材料：分离蛋白质等大分子物质分离蛋白质等大分子物质纤维素纤维素价格及分辨率、稳定度低，适于初价格及分辨率、稳定度低，适于初步分离和大量制备步分离和大量制备葡聚糖葡聚糖分辨率和价格适中，受外界影响大分辨率和价格适中，受外界影响大琼脂糖琼脂糖机械稳定性较好，分辨率较高，但机械稳定性较好，分辨率较高，但价格较贵价格较贵50流程：充分溶胀流程：充分溶胀去除杂质和细小颗粒去除杂质和细小颗粒用酸碱分用酸碱分别浸泡水洗至中性别浸泡水洗至中性排除气泡排除气泡说明：说明：市售阳离子交换市售阳离子交换树脂一般树脂一般为为NaNa型，阴离子交
17、换型，阴离子交换树树脂一般脂一般为为ClCl型。型。处理时一般阳离子交换处理时一般阳离子交换树脂树脂最后用最后用NaOHNaOH碱处理，碱处理，阴离子交换阴离子交换树脂树脂最后用最后用HClHCl酸处理。使用的酸碱浓度酸处理。使用的酸碱浓度一般小于一般小于2 2 M M，浸泡时间一般，浸泡时间一般30 min30 min。2.2.离子交换剂的处理离子交换剂的处理51离子交换用的层析柱一般离子交换用的层析柱一般粗而短粗而短；直径和柱长比一；直径和柱长比一般为般为1:101:10到到1:501:50之间；之间；层析柱安装要垂直；装柱时要均匀平整，不能有气层析柱安装要垂直；装柱时要均匀平整，不能有气
18、泡。泡。3.3.层析柱层析柱52l平衡缓冲液的离子强度和平衡缓冲液的离子强度和pHpH的选择首先要保证各个待的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定；分离物质如蛋白质的稳定；l要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。差别。4.4.平衡缓冲液平衡缓冲液 平衡缓冲液平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。换柱的缓冲液。53离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和离子交换层析的上样时应注意样品
19、液的离子强度和pHpH值，上柱量应小于工作交换量，一般为值，上柱量应小于工作交换量，一般为1-10%1-10%。上柱：正上柱，反上柱（倒上柱）上柱：正上柱，反上柱（倒上柱）5.5.上样上样54在离子交换层析中一般常用在离子交换层析中一般常用梯度洗脱梯度洗脱，通常有，通常有改变离子改变离子强度强度和和改变改变pHpH两种方式。两种方式。改变离子强度改变离子强度洗脱过程中逐步增大离子强度，洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来。从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来。改变改变pHpH的洗脱的洗脱对于阳离子交换剂一般是对于阳离子交换剂一般是pHpH从低从低到高洗脱
20、，阴离子交换剂一般是到高洗脱，阴离子交换剂一般是pHpH从高到低。从高到低。由于由于pHpH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用通常采用改变离子强度改变离子强度的梯度洗脱。的梯度洗脱。6.6.洗脱缓冲液洗脱缓冲液保证在洗脱液梯度范围内，所有组分都是稳定的。保证在洗脱液梯度范围内，所有组分都是稳定的。要使结合在离子交换剂上的所有组分在洗脱液梯度范围内都要使结合在离子交换剂上的所有组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱。能够被洗脱。梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。洗脱液的选择：洗脱液的选择：55 洗脱液的流速也会影响离
21、子交换层析分离效果，洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好。但过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、但过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用。分辨率降低等副作用。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。洗脱速度。7.7.洗脱速度洗脱
22、速度56 离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层且体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行析得到的样品要进行浓缩浓缩、脱盐脱盐处理。处理。8.8.样品的浓缩、脱盐样品的浓缩、脱盐9 9离子交换剂的再生和转型离子交换剂的再生和转型 再生：是指对使用过的离子交换剂进行处理，使其再生：是指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。恢复原来性状的过程。离子交换剂的转型：是指离子交换剂由一种平衡离离子交换剂的转型：是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。子转为另一种平衡离子
23、的过程。57六、离子交换树脂的应用六、离子交换树脂的应用1.1.水的净化水的净化2.2.小分子物质的分离：树脂型离子交换剂小分子物质的分离：树脂型离子交换剂3.3.大分子物质分离：亲水性离子交换剂大分子物质分离：亲水性离子交换剂58第五节第五节 亲和层析技术亲和层析技术 亲和层析（亲和层析（Affinity ChromatographyAffinity Chromatography）是利用）是利用生物分子间生物分子间专一的亲和力专一的亲和力而进行分离的一种层析而进行分离的一种层析技术。技术。优点：优点：高度选择性、操作条件温和、应用范围窄高度选择性、操作条件温和、应用范围窄缺点：缺点：层析剂价
24、格贵层析剂价格贵 59一、亲和层析的分离原理一、亲和层析的分离原理 被固定在载体（基质）上的分子称为被固定在载体（基质）上的分子称为配体（配基），配体（配基），配体和载体共价结合，构成亲和层析的固定相配体和载体共价结合，构成亲和层析的固定相亲亲和吸附剂。和吸附剂。利用目标分子与其配体之间的特异性生物利用目标分子与其配体之间的特异性生物亲和力（亲和力（特异、可逆特异、可逆），对其进行分离。），对其进行分离。配体配体载体载体目标分子目标分子60 选择并制备合适的亲和吸附剂选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键是亲和层析的关键步骤之一。它包括步骤之一。它包括:选择合适的配体、载体和连接臂；选择合
25、适的配体、载体和连接臂；将配体偶联到载体上；将配体偶联到载体上；封闭偶联载体上的裸露活化集团；封闭偶联载体上的裸露活化集团；储存亲和吸附剂。储存亲和吸附剂。一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的载体，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。析的载体，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。Pharmacia公司的公司的Sepharose4B、6B是目前应用较多是目前应用较多的载体基质。的载体基质。二、亲和吸附剂二、亲和吸附剂1 1、载体、载体61基质的活化是
26、指通过对基质进行一定的化学处理，基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。配体和基质的偶联，通常配体结合的活性基团。配体和基质的偶联，通常首先要进行基质的活化。首先要进行基质的活化。2 2、基质的活化、基质的活化62 在配体和基质之间引入适当长度的在配体和基质之间引入适当长度的“间隔臂间隔臂”，即，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长，这样就可以外扩展伸长，这样就可以减少空间位阻效应减少空间位阻效应，大大增加，大大增加
27、配体对待分离的生物大分子的吸附效率。配体对待分离的生物大分子的吸附效率。3 3、间隔臂分子、间隔臂分子 目前已有多种活化的基质以及偶联各种配体的亲和吸目前已有多种活化的基质以及偶联各种配体的亲和吸附剂制成商品出售，可以省去基质活化、配体偶联等复杂附剂制成商品出售，可以省去基质活化、配体偶联等复杂的步骤的步骤。加入手臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长加入手臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易造成弯曲，反而降低吸附效率。则容易造成弯曲，反而降低吸附效率。63三、亲和层析的基本操作三、亲和层析的基本操作1.装柱装柱2.平衡平衡3.制备粗样制备粗样4.加样（吸附）加样（吸附）5.洗去杂蛋白洗去杂蛋白6.洗脱（特异性洗脱、非特异性洗脱）洗脱（特异性洗脱、非特异性洗脱）7.再生与保存再生与保存64END!65