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1、食品分析食品分析Food analysisFood analysis 层析技术层析技术层析技术层析技术层层析析法法也也称称色色谱谱法法，是是19061906年年俄俄国国植植物物学学家家发发现现并并命命名名的的。他他将将植植物物叶叶子子的的色色素素通通过过装装填填有有吸吸附附剂剂的的柱柱子子，各各种种色色素素以以不不同同的的速速率率流流动动后后形形成成不不同同的的色色带带而而被被分分开开，由由此此得得名名为为“色色谱谱法法”。引言引言后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。19441944年出现年出现纸层析纸层析。以后层析法不断发展，相继出现以后层析法不断发展，相
2、继出现气相层析气相层析、高压液相高压液相层析层析、薄层层析薄层层析、亲和层析亲和层析、凝胶层析凝胶层析等。等。层析法的基本原理层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分层析法是利用混合物中各组分物理化学性质物理化学性质的差异的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在数等），使各组分在两相两相（一相为固定的，称为（一相为固定的，称为固定固定相相；另一相流过固定相，称为；另一相流过固定相，称为流动相流动相）中的）中的分布程度分布程度不同不同，从而使各组分以不同的，从而使各组分以不同的速度移动速度移动而达到分离的而达到分离的目
3、的。目的。层析法的分类层析法的分类按两相所处的状态分类：按两相所处的状态分类：流动相流动相有两种状态：有两种状态：*液体作为流动相液体作为流动相 *气体作为流动相气体作为流动相 固定相固定相也有两种状态：也有两种状态：*固体吸附剂作为固定相固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分为：按两相所处的状态分为：液相层析液相层析 液液-固层析固层析 液液-液层析液层析 气相层析气相层析 气气-固层析固层析 气气-液层析液层析按层析过程的机理分类按层析过程的机理分类吸附层析吸附层析：利用吸附剂对不同组分利用吸附剂对不同组分吸附性能吸附性能的差
4、的差异，从而达到分离鉴定的目的。异，从而达到分离鉴定的目的。分配层析分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间利用不同组分在流动相和固定相之间的的分配系数分配系数不同，使之分离。不同，使之分离。离子交换层析离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂利用不同组分对离子交换剂亲和亲和力力的不同，使之分离。的不同，使之分离。凝胶层析凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组利用某些凝胶对于不同分子大小的组分分阻滞作用阻滞作用的不同，使之分离。的不同，使之分离。n按操作形式不同分类按操作形式不同分类 柱柱层层析析：将将固固定定相相装装于于柱柱内内，使使样样品品沿沿一一个个方方向向移动移动从而达到分离。从而
5、达到分离。纸纸层层析析：用用滤滤纸纸做做液液体体的的载载体体，点点样样后后，用用流流动动相展开相展开，以达到分离鉴定的目的。，以达到分离鉴定的目的。薄薄层层层层析析：将将适适当当粒粒度度的的吸吸附附剂剂铺铺成成薄薄层层，以以纸纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。柱层析柱层析把吸附剂装在一支玻璃管中把吸附剂装在一支玻璃管中,做成做成色谱柱色谱柱。然。然 后将试液加在柱内，若试液中含有后将试液加在柱内，若试液中含有A A、B B两种组两种组分，则分，则A A和和B B便被便被吸附剂吸附剂（固定相）吸附在柱的（固定相）吸附在柱的上端。再用一种上端。再用一种洗脱剂
6、洗脱剂（流动相）进行冲脱，（流动相）进行冲脱，这时在管内就连续不断发生这时在管内就连续不断发生溶解、吸附、再溶溶解、吸附、再溶解、再吸附解、再吸附的现象。的现象。如果对如果对A A的吸附能力较弱，则的吸附能力较弱，则A A就较易溶解而较就较易溶解而较难吸附，在柱中移动就较快。当冲洗到一定程难吸附，在柱中移动就较快。当冲洗到一定程度时，两者即可以完全分开，形成度时，两者即可以完全分开，形成两个带两个带。在继续冲洗，在继续冲洗，A A物质便从柱中流出来，将流出液物质便从柱中流出来，将流出液承接于一个容器中。然后承接于一个容器中。然后B B物质被洗脱下来，用物质被洗脱下来，用另一个容器承接。这样便可
7、将另一个容器承接。这样便可将A A、B B两种物质两种物质分分离离。如下图所示如下图所示纸层析纸层析这是一种这是一种微量分离微量分离方法。方法。用用滤纸滤纸做载体，利用纸上吸着的做载体，利用纸上吸着的水分作为固定相水分作为固定相，将，将滤纸条点试液的一端浸在滤纸条点试液的一端浸在有机溶剂有机溶剂中（注意不要把原中（注意不要把原点浸入有机溶剂中）该点浸入有机溶剂中）该有机溶剂为流动相有机溶剂为流动相（展开剂）。（展开剂）。由于滤纸条毛细管的作用。流动相将不断上升，当流由于滤纸条毛细管的作用。流动相将不断上升，当流动相上升的时候，与点在滤纸条上的试样相遇，这时动相上升的时候，与点在滤纸条上的试样相
8、遇，这时试样中欲分离的组分就溶解在流动相中并随之上升。试样中欲分离的组分就溶解在流动相中并随之上升。当欲分离的组分遇到上面的固定相时，又溶解在固定当欲分离的组分遇到上面的固定相时，又溶解在固定相中而停下来，接着又被不断上升的流动相所溶解。相中而停下来，接着又被不断上升的流动相所溶解。于是就在两相之间一次又一次地发生于是就在两相之间一次又一次地发生分配分配过程（相当过程（相当于一次又一次的萃取），从而将各组分逐个分开。于一次又一次的萃取），从而将各组分逐个分开。薄层层析薄层层析利用利用吸附剂对化合物吸附能力的不同吸附剂对化合物吸附能力的不同而达到分离，吸而达到分离，吸附剂吸附能力的大小与化合物附
9、剂吸附能力的大小与化合物极性大小极性大小有关。有关。由于硅由于硅胶或氧化胶或氧化铝薄薄层的毛的毛细管作用，展开管作用，展开剂将沿着薄将沿着薄层逐逐渐上升。在上升上升。在上升过程中，当遇到新的吸附程中，当遇到新的吸附剂时，又被，又被吸附下来。接着又被不断流吸附下来。接着又被不断流过的展开的展开剂溶解，再随着溶解，再随着展开展开剂继续上升。上升。试样中中的的各各个个组分分将将按按照照它它们对硅硅胶胶或或氧氧化化铝吸吸附附能能力力强弱弱的不同而分离开来。的不同而分离开来。化合物化合物极性大极性大，被吸附剂吸附得牢，被吸附剂吸附得牢，RfRf值小值小，反之，反之，化合物极性小，化合物极性小，RfRf值
10、大。值大。特点：薄层层析法分离迅速，一般特点：薄层层析法分离迅速，一般1560min1560min内内可以完成，操作简便，灵敏度高。可以完成，操作简便，灵敏度高。近年广泛应该在制药、农药、染料、抗生素等近年广泛应该在制药、农药、染料、抗生素等工业中。工业中。薄层层析操作方法薄层层析操作方法1、硅胶、硅胶CMCNa薄层板的制备：薄层板的制备：称称取取CMCNa(羧羧甲甲基基纤纤维维素素钠钠)0.15g溶溶于于30mL蒸蒸馏馏水水中中搅搅拌拌(如如不不溶溶可可加加热热)至至全全部部溶溶解解加加入入层层析析用用硅硅胶胶10g充充分分搅搅拌拌均均匀匀，研研磨磨成成糊糊状状倒倒入入玻玻璃璃板板，用用食食
11、指指和和拇拇指指拿拿住住玻玻片片，作作前前后后左左右右轻轻轻轻摇摇动动，至至流流动动的的硅硅胶胶均均匀匀地地铺铺在在玻玻璃璃片片上上,水水平平放放置置，室室温温阴阴干干至至无无水水气气存存在在于于105烘烘箱箱中中活活化化2h干干燥燥器器中中冷冷却却备用备用2、点样、点样选取制备好的薄板一块，在距底边选取制备好的薄板一块，在距底边2cm的水平直线上的水平直线上选几个点，各选几个点，各点间距点间距1.5或或2cm，离板边约有，离板边约有lcm的距的距离。用毛细管分别点上不同的样品于各个点，样品量离。用毛细管分别点上不同的样品于各个点，样品量控制在控制在510g，斑点直径斑点直径一般为一般为23m
12、m，干后再点，干后再点一次。一次。3、展层、展层点样完毕，待薄层上样品点样完毕，待薄层上样品自然干燥自然干燥后，将薄板置于盛后，将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中，薄板与液面成有层析溶剂的层折缸中，薄板与液面成15左右的夹左右的夹角，点有样品的一端浸入溶剂中，深达角，点有样品的一端浸入溶剂中，深达0.5cm左右、左右、扩展剂液面应低于点样线，盖好层析槽盖，扩展剂液面应低于点样线，盖好层析槽盖，自下向上自下向上展层展层，当展层溶剂到达离薄板顶端约，当展层溶剂到达离薄板顶端约1cm处时取出薄处时取出薄板，标出溶剂前沿位置，用热风吹干。板，标出溶剂前沿位置，用热风吹干。4、显色：、显色：除尽溶剂后用喷
13、雾器均匀地喷上显色剂，烘干使其显除尽溶剂后用喷雾器均匀地喷上显色剂，烘干使其显色，计算色，计算Rf值值。或使之出现各种有色的斑点，与标准进行对照比较，或使之出现各种有色的斑点，与标准进行对照比较，可确定其成分。可确定其成分。Rf=起始线到样品斑点中心距离起始线到样品斑点中心距离/起始线到溶剂前沿的起始线到溶剂前沿的距离距离1 1、吸附层析技术、吸附层析技术吸附层析法（液吸附层析法（液-固色谱法，固色谱法，LSCLSC）原理原理 利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力吸附力的大小的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）
14、的差异进行分离。异进行分离。特点特点 适合分离不同种类的化合物适合分离不同种类的化合物(醇类和芳香烃）醇类和芳香烃）二、吸附剂二、吸附剂吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，活性多孔固吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，活性多孔固体与待分离物质的极性官能团作用。体与待分离物质的极性官能团作用。常用的吸附剂有常用的吸附剂有活性炭活性炭、硅石硅石、氧化铝氧化铝、羟基磷灰石羟基磷灰石等。等。羟基磷灰石（羟基磷灰石（HAHA）CaCa1010(PO(PO4 4)6 6.(OH).(OH)2 2,可用于分离蛋白可用于分离蛋白质与核酸。其表面有质与核酸。其表面有CaCa2+2+和和POPO4 43-3-两种
15、带电基团；两种带电基团；酸性酸性和中性蛋白质可与和中性蛋白质可与CaCa2+2+结合；碱性蛋白质可与结合；碱性蛋白质可与POPO4 43-3-结结合。合。HAHA柱层析最重要的用途之一是分离单链柱层析最重要的用途之一是分离单链DNADNA和双链和双链DNADNA，因为它对双链，因为它对双链DNADNA的亲和力大于单链的亲和力大于单链DNADNA。2 2、分配层析技术、分配层析技术分配层析法（液分配层析法（液-液层析法，液层析法，LLCLLC）原理原理 利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的之间的分配系数分配系数的不同而达到分离各组
16、分的目的的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。相。分配系数：分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在两当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在两种溶剂中的种溶剂中的浓度之比浓度之比是个常数，称为分配系数。是个常数，称为分配系数。K=c1/c2K=c1/c2 分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开移动慢。因此可彼此分开特点：特点：液液-液
17、层析法适合于分离液层析法适合于分离同系物同系物或或同分异构体同分异构体A ABCDE321616 8 16 8 4 4 12 12 2 2 8 12 8层析柱分离物质的示意图层析柱分离物质的示意图固固定定相相为为固固体体颗颗粒粒，装装在在层层析析柱柱内内，高高5cm5cm，固固定定相相周周围围充充满满液液体体流流动动相相，每每厘厘米米柱柱中中液液相相体体积积为为1cm1cm3 3。若若在在柱柱顶顶加加入入1cm1cm3 3溶溶剂剂,其其中中含含32mg32mg样样品品，同同时时应应有有相相同同体体积积的的溶溶剂剂从从柱柱底底流流出出，此此时时样样品品处处于于柱柱中中A A位位置置。若若样样品品
18、的的分分配配系系数数是是1 1，则则它它在在固固相相与与液液相相间间等等量量分分配配。若若再再有有1cm1cm3 3的的溶溶剂剂加加到到柱柱上上，A A部部分分中中的的溶溶剂带着剂带着16mg16mg的物质向下移动到的物质向下移动到B B，A A和和B B中的物质都将发生再分配中的物质都将发生再分配.3 3、凝胶过滤层析技术、凝胶过滤层析技术基本原理基本原理概念概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据根据它们分子大小不同而进行分离的技术。它们分子大小不同而进行分离的技术。原理原理凝胶颗粒内部具有多
19、孔网状结构，被分凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。度较慢，最后被洗脱出来。凝胶颗粒凝胶颗粒凝胶过滤在试验室中的应用凝胶过滤在试验室中的应用1 1）生物大分子物质的分离纯化）生物大分子物质的分离纯化2 2）分子量的测定
20、）分子量的测定3 3）分级分离）分级分离4 4）溶液浓缩）溶液浓缩5 5）平衡常数的测定）平衡常数的测定6 6）细胞及颗粒的分离）细胞及颗粒的分离LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测LogM=kLogM=k1 1-k-k2 2VeVe蛋白质通过凝胶柱的速度即蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积洗脱体积与其与其分子量分子量有关，有关，（VeVe为洗脱体积）为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的先测得几种标准蛋白质的VeVe，并以其分子量对数对，并以其分子量对数对VeVe作图得一直线，再测出作图得一直线，再测出待测样品的待测样品的VeVe，查标准曲，查标准曲线即可确定分子量。线
21、即可确定分子量。原理原理 根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲亲和力不同和力不同而达到分离的目的。而达到分离的目的。将离子交换树脂装入层析柱。将离子交换树脂装入层析柱。离子交换树脂通常是离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质不溶于水的高分子物质，分，分子中含有可解离的基团子中含有可解离的基团.含有酸性可解离基团的称含有酸性可解离基团的称为为阳离子交换树脂阳离子交换树脂，可解离出，可解离出 H H+，含有碱性可解离基团的称，含有碱性可解离基团的称 为为阴离子交换树脂阴离子交换树脂，可解离出，可解离出 OH OH-4 4、离子交换层析法、离子交换层析法离子
22、交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理+若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+H+发生交换而结合在发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-OH-发生发生交换而结合在树脂上。交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小亲和力大小有差异，因此选用适当有差异，因此选用适当的的洗脱液洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。的。+原理原理 利利用用生生物物大大分分子
23、子间间特特异异的的亲亲和和能能力力来来纯纯化化生生物物大大分分子子 如如：抗抗原原和和抗抗体体 ；酶酶和和底底物物或或辅辅酶酶或或抑抑制制剂剂 ；激激素和受体；素和受体；RNA RNA和其互补的和其互补的DNADNA等。等。将将待待纯纯化化物物质质的的特特异异配配体体通通过过适适当当的的化化学学反反应应共共价价的的连连接接到到载载体体上上，待待纯纯化化的的物物质质可可被被配配体体吸吸附附，杂杂质质则则不不被被吸吸附附，通通过过洗洗脱脱杂杂质质即即可可除除去去。被被结结合合的的物物质质再再用含用含游离的相应配体溶液游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。把它从柱上洗脱下来。5 5、亲和层析法、亲和
24、层析法+CCC配基配基蛋白质蛋白质1.配基固相化配基固相化2.亲和吸附亲和吸附固固体体载载体体3.解吸附解吸附6 6、免疫亲和层析柱（、免疫亲和层析柱（IACIAC）近近 年年 来来 免免 疫疫 亲亲 和和 层层 析析 柱柱（IACIAC）开开始始被被用用于于有有选选择择性性地地从从复复杂杂基基体体样样本本中中提提取取（净净化化）小小分分子子待待测测物物，如如药药物物、激激素素、农农药药和和真真菌菌毒毒素等。素等。IACIAC技技术术简简化化了了小小分分子子待待测测物物样样品品净净化化程程序序，避避免免了了大大量量有有毒毒、有有异异味味的的有有机机溶溶剂剂的的使用。使用。吸附原理吸附原理待待测
25、测物物被被柱柱子子中中免免疫疫吸吸附附剂剂上上的的抗抗体体所所吸吸附附，通通过过淋淋洗洗除除去去柱柱上上吸吸附附的的杂杂质质，最最后后待待测测样样品品被被一一种种易易蒸蒸发发的的溶溶剂剂洗洗脱脱下下来来。用用IACIAC技技术术，样样品品通通常常只只经经过过一一次次萃萃取取就就可可直直接接用用于于薄薄层层色色谱谱法法、荧荧光光光光度度法法、HPLCHPLC或或GC-MSGC-MS测测定，也可用免疫学方法检测。定，也可用免疫学方法检测。工作原理工作原理7 7、高压液相层析（、高压液相层析（HPLCHPLC）特点特点 使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分因而分辨率很高。辨率很高。溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。许多类型的柱层析都可用许多类型的柱层析都可用HPLCHPLC来代替，如分配层析、来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。