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1、 基因治疗Company Logo目录基因治疗的发展史1基因治疗的概述2基因治疗的策略3 问题互动5基因治疗的方式4Company Logo基因治疗的定义v基因治疗（基因治疗（gene therapy）v是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治
2、疗某种疾病。造的产物能治疗某种疾病。v从广义说，凡是在基因水平上进行操作而达到治疗疾病从广义说，凡是在基因水平上进行操作而达到治疗疾病的所有疗法。的所有疗法。Company Logo基因治疗的发展史时间发生事件研究者1944DNA是转化物质Avery1953DNA双螺旋结构模型Watson and Crick1963遗传密码的破译Brenner1979重组体DNA技术、基因转染Mulligan and Berg1980临床地贫研究Cline1990第一个临床试验（ADA)基因Blas and Anderson1992大量癌症临床试验美国等1993中国制定第一部基因治疗质控要点中国1997至今重
3、组病毒的产业化及其技术改进美国Company Logo基因治疗的发展史v上世纪九十年代初，一位因上世纪九十年代初，一位因ADA(ADA(腺苷酸脱氨酶腺苷酸脱氨酶)基因缺陷导致严重免疫缺损的四岁女孩，由美基因缺陷导致严重免疫缺损的四岁女孩，由美国国立卫生研究院用国国立卫生研究院用ADAADA基因治疗，取得疗效。基因治疗，取得疗效。“基因治疗基因治疗”研究热从此波及全世界，起而效研究热从此波及全世界，起而效颦，为保障人类健康展现了美好的前景。颦，为保障人类健康展现了美好的前景。Company Logo基因治疗的发展史v人民网深圳人民网深圳20032003年年1010月月2222日日1515：303
4、0急电急电 正在这里召开正在这里召开的深圳市政府新闻发布会向世界公布了一项振奋人心的的深圳市政府新闻发布会向世界公布了一项振奋人心的消息：消息：“个基因治疗药物在中国诞生个基因治疗药物在中国诞生”。v世界首深圳市赛百诺基因技术有限公司研制开发的抗癌世界首深圳市赛百诺基因技术有限公司研制开发的抗癌新药新药“重组人重组人p53p53腺病毒注射液腺病毒注射液”（商品名（商品名“今又今又生生”），），1010月月1616日获得国家仪器药品监督管理局颁发的日获得国家仪器药品监督管理局颁发的新药证书。这标志着我国在基因治疗药物研制和产业化新药证书。这标志着我国在基因治疗药物研制和产业化方面已达世界领先水平
5、，在国际竞争中抢占了先机。方面已达世界领先水平，在国际竞争中抢占了先机。世界第一个基因治疗药物在中国诞生Company Logo基因治疗的概述基因治疗的基本内容：基因治疗的基本内容：v基因诊断：产生基因缺陷的原因除了进化障碍基因诊断：产生基因缺陷的原因除了进化障碍因素外，主要包括点突变、缺失、插入、重排因素外，主要包括点突变、缺失、插入、重排等等DNADNA分子畸变事件的发生。分子畸变事件的发生。目前已建立多种病变基因的诊断和定位方法：目前已建立多种病变基因的诊断和定位方法：如如PCRPCR扩增序列法、单链构型多态性分析法、人扩增序列法、单链构型多态性分析法、人类基因库搜寻法等类基因库搜寻法等
6、Company Logo基因治疗的发展史v基因分离：利用基因分离：利用DNADNA重组技术克隆、鉴定、扩增、重组技术克隆、鉴定、扩增、纯化用于治疗的正常基因，并根据病变基因的定纯化用于治疗的正常基因，并根据病变基因的定位，与特异性整合序列和基因表达调控原件进行位，与特异性整合序列和基因表达调控原件进行体外重组操作。体外重组操作。v载体构建：主要有病毒和非病毒两大类，病毒载载体构建：主要有病毒和非病毒两大类，病毒载体一般都需要重新构建。体一般都需要重新构建。v基因转移：关系到基因治疗成败的关键单元操作基因转移：关系到基因治疗成败的关键单元操作Company Logo基因治疗的概述根据靶细胞不同，
7、基因治疗分为：根据靶细胞不同，基因治疗分为：v 将正常基因转移到体细胞，使之表达将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的。基因产物，以达到治疗目的。v 将正常基因转移到患者的生殖细胞将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞中早期胚胎）使其发育成正常个体，（精细胞、卵细胞中早期胚胎）使其发育成正常个体，显然，这是理想的方法。实际上，这种靶细胞的遗传修显然，这是理想的方法。实际上，这种靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展。饰至今尚无实质性进展。体细胞基因治疗体细胞基因治疗：生殖细胞基因治疗：生殖细胞基因治疗：Company Logo基因治疗的概述v生殖细胞的基因治疗不仅可使遗传
8、疾病在当代得到治疗，生殖细胞的基因治疗不仅可使遗传疾病在当代得到治疗，而且还能将新基因传给患者后代，使遗传病得到根治。而且还能将新基因传给患者后代，使遗传病得到根治。但生殖细胞的基因治疗涉及问题较多，技术也较复杂。但生殖细胞的基因治疗涉及问题较多，技术也较复杂。v因此，如今更多地是采用体细胞基因治疗。因此，如今更多地是采用体细胞基因治疗。v体细胞应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂体细胞应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地、长期能力的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地、长期地发挥地发挥“治疗治疗”作用。因此作用。因此干干细细胞胞、前体细胞
9、都是理想、前体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。的转基因治疗靶细胞。Company Logo基因治疗的策略v体细胞基因治疗的策略体细胞基因治疗的策略：v基因修正基因修正v基因置换基因置换v基因基因激活激活v基因增补基因增补v基因干扰基因干扰v免疫调节免疫调节v药物敏感疗法药物敏感疗法基因治疗的策略v（一）基因修正一）基因修正v通过特定的方法如同源重组或靶向突变等对突变的通过特定的方法如同源重组或靶向突变等对突变的DNADNA进进行原位修复行原位修复,将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。分予以保留。v但目前在技术上还无法做到。因为要在人基因组的某
10、个特但目前在技术上还无法做到。因为要在人基因组的某个特异部位上进行重组是一个非常复杂的过程。然而原位修复异部位上进行重组是一个非常复杂的过程。然而原位修复的方法无疑是进行基因治疗最理想的途径和目的。的方法无疑是进行基因治疗最理想的途径和目的。基因治疗的策略（二）基因置换二）基因置换 基因置换指去除整个变异基因，用有功能的正常基因置换指去除整个变异基因，用有功能的正常基因取代之，使致病基因得到永久地更正。传统基因取代之，使致病基因得到永久地更正。传统上所谓基因治疗实际上就是指基因替代疗法，就上所谓基因治疗实际上就是指基因替代疗法，就像外科移植手术一样。像外科移植手术一样。基因治疗的策略（三）基因
11、激活三）基因激活 有些正常基因不能表达并发生了基因突变，而是由有些正常基因不能表达并发生了基因突变，而是由于被错误地甲基化或编码区组蛋白去乙酰化所致；也有的于被错误地甲基化或编码区组蛋白去乙酰化所致；也有的是编码区是正常的但调控区发生了突变。是编码区是正常的但调控区发生了突变。前者可以通过去甲基化或乙酰化使基因恢复活性；后前者可以通过去甲基化或乙酰化使基因恢复活性；后者可以加入正常启动子来激活基因。者可以加入正常启动子来激活基因。但是实现定点去甲基化和乙酰化也非易事；原位修复但是实现定点去甲基化和乙酰化也非易事；原位修复调控序列也是很难的。调控序列也是很难的。基因治疗的策略（四）基因增补四）基
12、因增补 又称基因修饰，是指将目的基因导入病变细胞或其他又称基因修饰，是指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能会使原细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能会使原有的某些功能得以加强。有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式。前基因治疗多采用这种方式。基因治疗的策略（五）基因干扰五）基因干扰 又称基因失活，有两种干扰方法：又称基因失活，有两种干扰方法：1 1、抑制有害的基因表达、抑制有害的基因表达：导入肿瘤抑制基因，：导入肿瘤抑制基因，（如（如rbrb或或p5
13、3),p53),以抑制癌基因的异常表达。以抑制癌基因的异常表达。2 2、封闭有害基因：用反义、封闭有害基因：用反义RNARNA或小分子干扰或小分子干扰RNARNA来疯币癌基因，来疯币癌基因，同样不能恢复癌基因的正常功能，但可用来抑制病原体的关同样不能恢复癌基因的正常功能，但可用来抑制病原体的关键基因。键基因。基因治疗的策略（六）免疫调节六）免疫调节 将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内，改变患者将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内，改变患者的免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。的免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素如将白细胞介素-2-2导入肿瘤患者体内，提高患者导入肿瘤患
14、者体内，提高患者IL-2IL-2的水的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。的目的。基因治疗的策略（七）药物敏感疗法七）药物敏感疗法 应用药物敏感基因转染肿瘤细胞，以提高肿瘤细胞应用药物敏感基因转染肿瘤细胞，以提高肿瘤细胞对药物的敏感性。对药物的敏感性。如向肿瘤细胞导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后如向肿瘤细胞导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后给予患者无毒性的环氧鸟苷药物。肿瘤细胞被杀死，而对给予患者无毒性的环氧鸟苷药物。肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。正常细胞无影响。基因治疗的策略一些常见疾病的基因治疗策略：一些常见
15、疾病的基因治疗策略：基因治疗的方式1.1.直接体内疗法（直接体内疗法（in vivoin vivo）是指将目的基因直接导入体内有关的组织器是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。官，使其进入相应的细胞并进行表达。2.2.间接体内疗法（间接体内疗法（ex vivoex vivo）是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。基因治疗的方式直接体内疗法（直接体内疗法（in viv
16、oin vivo）、利用反转录病毒载体时，要求靶细胞处于、利用反转录病毒载体时，要求靶细胞处于分裂期，但许多需进行基因治疗的组织多处分裂期，但许多需进行基因治疗的组织多处于静止期于静止期、目前用温和病毒载体直接注入相应的组织、目前用温和病毒载体直接注入相应的组织基因治疗的方式 间接体内疗法（间接体内疗法（ex vivoex vivo）、从患者体内取出带有缺陷基因的细胞，并培养；、从患者体内取出带有缺陷基因的细胞，并培养；、将带有目的基因的载体通过转染或感染转移到培、将带有目的基因的载体通过转染或感染转移到培 养的靶细胞中，进行遗传修正养的靶细胞中，进行遗传修正、对遗传修正的细胞进行选择和培养；
17、、对遗传修正的细胞进行选择和培养；、处理过的细胞用融合或移植的方法转入患者体内、处理过的细胞用融合或移植的方法转入患者体内Company Logo基因治疗的方式ex vivo载体载体将目的基因直接输入体内将目的基因直接输入体内目的基因目的基因in vivo将目的基因导入患者靶细胞将目的基因导入患者靶细胞,体外培养体外培养将重组靶细胞回输体内将重组靶细胞回输体内靶细胞靶细胞基因治疗的方式基因治疗的关键步骤：基因治疗的关键步骤：1 1、目的基因的选择、目的基因的选择2 2、靶细胞的选择、靶细胞的选择3 3、选择安全而有效的方法和载体系统，使外源、选择安全而有效的方法和载体系统，使外源基因顺利地导入
18、靶细胞，并有效表达从而达到基因顺利地导入靶细胞，并有效表达从而达到治疗目的。治疗目的。基因治疗的方式目的基因的选择目的基因的选择是根据不同的疾病、不同的治疗方式而定的是根据不同的疾病、不同的治疗方式而定的基因治疗的方式靶细胞的选择靶细胞的选择需考虑：需考虑：1 1、最好为组织特异性细胞、最好为组织特异性细胞2 2、细胞易获得，具有增殖优势，生命周期长、细胞易获得，具有增殖优势，生命周期长3 3、离体细胞较易受外源基因转化、离体细胞较易受外源基因转化4 4、细胞坚固，能耐受处理，回植到体内易成活、细胞坚固，能耐受处理，回植到体内易成活基因治疗的方式常用的靶细胞有：常用的靶细胞有：造血细胞、上皮细
19、胞、角质细胞、内皮细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、淋皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞等。巴细胞、肿瘤细胞等。Company Logo基因治疗的方式目的基因的转移方式：目的基因的转移方式：1.1.直接注射法直接注射法2.2.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法3.3.显微注射法显微注射法4.4.脂质体介导法脂质体介导法5.5.受体介导的基因转移受体介导的基因转移6.6.逆转录病毒载体介导的基因转移逆转录病毒载体介导的基因转移直接注射法 将目的基因直接注射到体内的某些部位将目的基因直接注射到体内的某些部位(如如肌肉肌肉)，邻近细胞摄人
20、，邻近细胞摄人DNADNA并表达。这种方法非并表达。这种方法非常简单，但效率低。常简单，但效率低。Company Logo磷酸钙沉淀法 将氯化钙、将氯化钙、DNADNA和磷酸盐缓冲液混合，即和磷酸盐缓冲液混合，即有磷酸钙微沉淀形成，体外培养的细胞可将沉有磷酸钙微沉淀形成，体外培养的细胞可将沉淀吞入细胞内，从而将目的基因导入细胞内。淀吞入细胞内，从而将目的基因导入细胞内。这种方法优点在于简单和通用性，但转化效率这种方法优点在于简单和通用性，但转化效率通常很低。通常很低。Company Logo显微注射法在显微镜下，直接将在显微镜下，直接将DNADNA由细胞玻璃针注人由细胞玻璃针注人细胞核内，可避
21、免细胞核内，可避免DNADNA的降解，但要求有熟练的降解，但要求有熟练的操作技巧。的操作技巧。脂质体介导法 将目的基因包裹到脂质体内，通过静脉注人将目的基因包裹到脂质体内，通过静脉注人体内，脂质体与细胞膜融合而使目的基因进人细体内，脂质体与细胞膜融合而使目的基因进人细胞内。脂质体介导的基因转移能在活体内应用，胞内。脂质体介导的基因转移能在活体内应用，较为简单，转移效率较低，转移的目的基因不与较为简单，转移效率较低，转移的目的基因不与染色体整合，只能短时间表达。染色体整合，只能短时间表达。受体介导的基因转移 将含有目的基因的重组质粒将含有目的基因的重组质粒DNADNA共价连接到能共价连接到能与某
22、种细胞受体结合的配体上，再将这种复合物注与某种细胞受体结合的配体上，再将这种复合物注人体内，配体与细胞受体特异性结合，发生正常的人体内，配体与细胞受体特异性结合，发生正常的人胞作用，目的基因从而进人细胞内。这种方式转人胞作用，目的基因从而进人细胞内。这种方式转人的目的基因也不与染色体整合，只能短时间表达。人的目的基因也不与染色体整合，只能短时间表达。逆转录病毒载体介导的基因转移 带有外源性基因的重组病毒在感染细胞时带有外源性基因的重组病毒在感染细胞时.可可将外源性基因序列导人细胞内。目前主要使用的病将外源性基因序列导人细胞内。目前主要使用的病毒载体有逆转录病毒和腺病毒。逆转录病毒可将遗毒载体有
23、逆转录病毒和腺病毒。逆转录病毒可将遗传物质整合到宿主细胞基因组内，因而很合适作基传物质整合到宿主细胞基因组内，因而很合适作基因治疗载体。将野生的逆转录病毒进行重组，除去因治疗载体。将野生的逆转录病毒进行重组，除去编码病毒自身蛋白的序列，插人目的基因。编码病毒自身蛋白的序列，插人目的基因。基因治疗的问题安全性问题安全性问题 1999 1999年首例基因治疗失败事件年首例基因治疗失败事件 只限于体细胞，提倡间接体内法、主要用只限于体细胞，提倡间接体内法、主要用于单基因遗传病治疗、疗效显著并经过动物于单基因遗传病治疗、疗效显著并经过动物实验验证等。实验验证等。社会伦理问题社会伦理问题 禁止用于生殖细
24、胞禁止用于生殖细胞 防止不当应用（如体育上）防止不当应用（如体育上）v目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性。事实上，自全性。事实上，自1995 1995 年以来，全世界基因治疗领年以来，全世界基因治疗领域的科学家们在改善基因导入系统和载体方面作了域的科学家们在改善基因导入系统和载体方面作了大量的努力，新思路、新技术和新方法层出不穷。大量的努力，新思路、新技术和新方法层出不穷。目前，在基因导入载体方面出现了两大主流：一是目前，在基因导入载体方面出现了两大主流：一是非病毒载体系统；二是病毒载体系统。非病毒载体系统；二是病毒载体系统。问题互动问题互动1 1、什么是基因治疗？、什么是基因治疗？v从广义说，凡是在基因水平上进行操作而达到治疗从广义说，凡是在基因水平上进行操作而达到治疗疾病的所有疗法。疾病的所有疗法。问题互动2 2、基因治疗的关键步骤是什么？、基因治疗的关键步骤是什么？v1、目的基因的选择、目的基因的选择v2、靶细胞的选择、靶细胞的选择v3、选择安全而有效的方法和载体系统、选择安全而有效的方法和载体系统问题互动2 2、基因干扰的干扰方法？、基因干扰的干扰方法？v抑制有害的基因表达抑制有害的基因表达v封闭有害基因封闭有害基因