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1、1.药物治疗药物治疗2.手术治疗手术治疗3.放射治疗放射治疗4.理疗理疗传统治疗方法传统治疗方法 新的生物治疗：新的生物治疗：基因治疗基因治疗(gene therapy)基基 因因 治治 疗疗一、一、概念概念二、二、策略策略三、三、基本流程基本流程四、四、应用与展望应用与展望一、基因治疗的概念Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells.基基因因治治疗疗是是指指改改变变细细胞胞遗遗传传物物质质为为基基础础的的生生物医学治疗。物医学治疗。概念的发展
2、概念的发展经典概念：经典概念：将具有正常功能的基因将具有正常功能的基因置换置换或或增补增补患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。的。广义概念：广义概念：将某种遗传物质将某种遗传物质转移转移至患者细胞内，至患者细胞内，使其在体内使其在体内有效表达有效表达，最终达到治疗疾病目的，最终达到治疗疾病目的的方法，均称之为基因治疗。的方法，均称之为基因治疗。二、基因治疗的策略二、基因治疗的策略(一一)直接策略直接策略：针对致病基因针对致病基因(二二)间接策略间接策略：导入与致病基因无直接联系的治疗基因导入与致病基因无直接联系的治疗基因(一一)直接策略直接策略1
3、.基因基因矫正矫正（gene correction）2.基因基因置换置换（gene replacement）3.基因基因增补增补（gene augmentation）又称为又称为补偿性补偿性基因治疗基因治疗 4.基因基因干预干预（gene interference）又称为又称为反义反义基因治疗基因治疗 1.基因基因矫正矫正（gene correction）指指将将致致病病基基因因的的突突变变碱碱基基加加以以纠纠正正，而而保留正常部分。保留正常部分。2.基因基因置换置换（gene replacement）指指通通过过同同源源重重组组（基基因因打打靶靶）技技术术，将将正正常常基基因因定定点点整整合
4、合到到靶靶细细胞胞基基因因组组内内，以以原位替换原位替换致病基因。致病基因。v不不涉涉及及基基因因组组整整体体改改变变的的情情况况下下对对缺缺陷陷基基因因进进行精确的行精确的原位修复原位修复，是，是最理想的治疗方式最理想的治疗方式。基因打靶技术基因打靶技术 指目的基因导入靶细胞后，通过目的基因指目的基因导入靶细胞后，通过目的基因与靶细胞内染色体上与靶细胞内染色体上同源同源DNA序列间的交换序列间的交换，将目的基因定点整合到靶细胞基因组上某一确将目的基因定点整合到靶细胞基因组上某一确定位点的技术。定位点的技术。3.基因基因增补增补（gene augmentation）成熟的策略成熟的策略 是指不
5、去除异常基因，将有功能的正常基因导是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生入病变细胞或其它细胞后发生非定点整合非定点整合，表，表达正常产物以达正常产物以补偿缺陷补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能，或使原有的功能得以加强。的功能得以加强。4.基因基因干预干预（gene interference）是采用特定的方法，导入外源基因选择性地阻断、是采用特定的方法，导入外源基因选择性地阻断、干扰、抑制和封闭有害基因在干扰、抑制和封闭有害基因在DNA、RNA和蛋白质和蛋白质水平的表达及其生物合成。水平的表达及其生物合成。导入导入抑癌基因抑癌基因反义核酸技术反义核酸技术(anti
6、sense technology)：反义反义RNA；反基因技术；反基因技术；核酶核酶RNA干扰干扰（RNA interference)抑癌基因疗法抑癌基因疗法v抑癌基因抑癌基因：是正常细胞内正常存在的，能抑制：是正常细胞内正常存在的，能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。Rb基因，基因，p53基因，基因，MTS基因，基因，nm23基因基因vp53基因治疗研究：基因治疗研究：（1）野生型）野生型p53基因的替代疗法基因的替代疗法 （2）突变型）突变型p53基因的阻断疗法基因的阻断疗法 （3）与）与p53基因有关的新型肿瘤疫苗基因有关的新型肿瘤疫苗反义核酸反义核酸1
7、.反义反义RNA（antisense RNA）：与）：与mRNA互补的互补的RNA，抑制，抑制mRNA的加工与翻译。的加工与翻译。2.核酶核酶（ribozyme）：具有催化功能的）：具有催化功能的RNA，其，其与相应与相应mRNA结合后能发挥酶活性，将结合后能发挥酶活性，将mRNA降解。降解。3.反义脱氧寡核苷酸，反义脱氧寡核苷酸，ODN反义反义RNA技术技术体外合成体外合成反义反义RNA，直接导入；，直接导入；将特异的反义基因通过特定的将特异的反义基因通过特定的表达载体表达载体（质（质粒、病毒）粒、病毒）导入细胞，转录出反义导入细胞，转录出反义RNA发挥发挥作用，避免了在给药途径中易被作用，
8、避免了在给药途径中易被RNase降解降解的缺点。的缺点。关键性问题关键性问题1.专一性转移专一性转移 如何专一的作用于病变细胞，而不影响其他如何专一的作用于病变细胞，而不影响其他正常细胞。正常细胞。2.反义反义RNA进入靶细胞前的进入靶细胞前的降解降解问题问题解决：解决：特定特定受体介导受体介导的反义的反义RNA转移转移受体介导的反义受体介导的反义RNA转移转移v 脱唾液酸糖蛋白（脱唾液酸糖蛋白（ASGP）受体）受体介导的转移，通介导的转移，通过化学物质作为中间连接物，将过化学物质作为中间连接物，将ASGP与与多聚赖多聚赖氨酸（氨酸（PL）共价结合，得到共价结合，得到ASGP-PL复合物，复合
9、物，这种复合物可以携带这种复合物可以携带RNA，再专一性地被肝细，再专一性地被肝细胞表面的胞表面的ASGP受体所识别，并被吞噬到肝细胞受体所识别，并被吞噬到肝细胞内发挥作用。内发挥作用。反义反义RNA应用前景应用前景1.安全性高安全性高 不改变基因结构，最终在细胞内被降解。不改变基因结构，最终在细胞内被降解。2.设计和制备方便设计和制备方便 体外转录体外转录获得。获得。3.具有剂量调节效应具有剂量调节效应4.能直接作用于一些能直接作用于一些RNA病毒病毒反基因技术反基因技术脱氧寡核苷酸脱氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucleotide,ODN），也被称），也被称为为TFO(trip
10、le helix-forming oligo)通过通过TFO在在DNA结合蛋白的识别位点处，与靶基因结结合蛋白的识别位点处，与靶基因结合形成三螺旋，从而位点专一性地干扰合形成三螺旋，从而位点专一性地干扰DNA与反式作与反式作用因子的结合，抑制转录起始或转录延伸，达到用因子的结合，抑制转录起始或转录延伸，达到“反基反基因因”的目的。的目的。DNA水平水平阻止基因转录阻止基因转录肽核酸肽核酸（peptide nucleic acids，PNA，一种以多肽骨架，一种以多肽骨架取代糖取代糖-磷酸骨架的磷酸骨架的DNA类似物）类似物）核核 酶酶 催化催化RNA切割和切割和RNA剪接剪接Recogniti
11、on sequences“hammerhead”ribozymes1981年，年，Cetch和和Alfman首次发现了一类具有特首次发现了一类具有特异性剪切异性剪切RNA活性的活性的RNA分子。分子。核酶具有稳定的空间结构，核酶具有稳定的空间结构，不易受到不易受到RNA酶酶的攻击的攻击。核酶在切断核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合并切割其他的来，重新结合并切割其他的mRNA，效率高效率高于反义于反义RNA。核酶的特点核酶的特点 RNA干扰技术干扰技术概念：概念：短的双链短的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使同源导入细胞，可以使同源mRNA发生特
12、异性的降解，从而阻断发生特异性的降解，从而阻断相应基因的表达。相应基因的表达。v 高度的序列专一性高度的序列专一性v 高效性高效性v 易操作性易操作性miRNAMicroRNA（miRNA）是内源性是内源性的，是一种非的，是一种非编码编码的的RNA；由；由miRNA基因表达出最初的基因表达出最初的pri-miRNA分子。分子。靶靶标标mRNA通常通常发发生不完全生不完全结结合，并且合，并且结结合的位点是合的位点是mRNA的非的非编码编码区的区的3端；它不会降解靶端；它不会降解靶标标mRNA，而只是阻止而只是阻止mRNA的翻的翻译译。miRNA能能够够调节调节与生与生长发长发育有关的基因育有关的
13、基因。在生物体中的表达具有在生物体中的表达具有时时序性、保守性和序性、保守性和组织组织特异性特异性(二二)间接策略间接策略导入与致病基因无直接联系的治疗基因导入与致病基因无直接联系的治疗基因1.1.免疫免疫基因治疗基因治疗 2.2.分子化疗分子化疗3.3.特异性细胞杀伤特异性细胞杀伤1.1.免疫基因治疗免疫基因治疗(1)细胞因子细胞因子基因治疗基因治疗 IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-、TNF-、G-CSF、GM-CSF(2)免疫增强免疫增强基因疗法基因疗法 MHC I类抗原、共刺激分子类抗原、共刺激分子(3)肿瘤肿瘤DNA疫苗疫苗疗法疗法 癌胚抗原（癌胚
14、抗原（CEA）制备的肿瘤）制备的肿瘤DNA疫苗疫苗 Tumour Necrosis Factor2.分子化疗(1)自杀基因自杀基因疗法：疗法：TK基因、基因、CD基因基因(2)化疗保护性化疗保护性基因治疗：基因治疗：MDR基因基因(3)药物增敏药物增敏基因治疗：基因治疗：钙调素基因钙调素基因 (1)(1)自杀基因疗法自杀基因疗法 自杀基因（自杀基因（suicide gene)，前体药物酶转化基因，前体药物酶转化基因该该基基因因表表达达产产生生的的酶酶可可催催化化无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转变变为为细胞毒性物质细胞毒性物质，从而杀死肿瘤细胞；，从而杀死肿瘤细胞；同同时时通通过过“旁旁观观
15、者者效效应应”（bystander effect）杀杀死死邻邻近近未导入该基因的分裂细胞而显著扩大杀伤效应。未导入该基因的分裂细胞而显著扩大杀伤效应。由由于于携携带带该该基基因因的的受受体体细细胞胞本本身身也也被被杀杀死死，所所以以这这类类基因被称为基因被称为“自杀基因自杀基因”。自杀基因单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒胸苷激酶（胸苷激酶（HSV-TK）基因）基因 编编码码胸胸苷苷激激酶酶（TK）催催化化丙丙氧氧鸟鸟苷苷（ganciclovir,GCV）成成为为磷磷酸酸化化的的核核苷苷酸酸类类似似物物，阻阻断断DNA的合成而使细胞死亡。的合成而使细胞死亡。大肠杆菌大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（胞嘧啶脱氨酶（C
16、D）基因）基因 将将5-氟氟胞胞嘧嘧啶啶（5-FC）转转化化为为5-氟氟尿尿嘧嘧啶啶（5-FU）而发挥细胞毒性作用。）而发挥细胞毒性作用。viral vector （HSV）Targeted Killing-Targeted Killing-Genetic Pro-drug Activation TherapyGenetic Pro-drug Activation Therapytumour cellthymidine kinasegeneganciclovir phosphateGanciclovir（GCV）tkGanciclovir phosphateinhibits DNA polym
17、eraseCell death Including bystander cells (2)(2)化疗保护性基因治疗化疗保护性基因治疗指指将将编编码码抗抗细细胞胞毒毒性性药药物物蛋蛋白白的的基基因因导导入入人人体体细胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力。细胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力。如如 将将 多多 药药 抗抗 性性（multiple drug resistance,MDR）基基因因MDR-1导导入入骨骨髓髓造造血血干干细细胞胞，减减少少骨骨髓髓受受抑抑制制的的程程度度，以以加加大大化化疗疗剂剂量量，提提高高化疗效果。化疗效果。(3)(3)药物增敏基因治疗药物增敏基因治疗将将外外源源基
18、基因因插插入入肿肿瘤瘤细细胞胞后后，改改变变肿肿瘤瘤细细胞胞对对药物的敏感性。药物的敏感性。如如将将钙钙调调素素基基因因转转入入癌癌细细胞胞，其其表表达达产产物物作作为为细细胞胞内内信信号号转转导导系系统统的的重重要要物物质质，明明显显增增强强肿肿瘤瘤细细胞胞对对化化疗疗药药物物的的吸吸收收量量而而相相应应减减少少了了排排出出量，量，使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。3.3.特异性细胞杀伤特异性细胞杀伤指指利利用用重重组组DNA技技术术将将生生物物来来源源的的细细胞胞毒毒素素基基因因与与一一些些特特异异受受体体的的配配体体基基因因融融合合，构构建建融融合合
19、基基因因，导导入入高高度度表表达达该该受受体体的的肿肿瘤瘤细细胞胞，以以特特异性杀伤该肿瘤细胞。异性杀伤该肿瘤细胞。特异性细胞杀伤特异性细胞杀伤如如将将绿绿脓脓杆杆菌菌外外毒毒素素（PE）或或白白喉喉毒毒素素（DT）基基因因与与TGF基基因因组组成成融融合合基基因因TGF-PE，或或TGF-DT。由由于于TGF与与表表皮皮生生长长因因子子EGF结结构构类类似似，也也能与表皮生长因子受体（能与表皮生长因子受体（EGFR）结合）结合；故故该该融融合合基基因因可可特特异异性性进进入入并并杀杀死死高高度度表表达达EGFR的的膀膀胱胱癌癌、肾肾癌癌、肺肺癌癌、乳乳腺腺癌癌等等肿肿瘤瘤细胞。细胞。三、基因
20、治疗的基本流程三、基因治疗的基本流程（一）（一）外源基因外源基因的选择与制备的选择与制备 （二）（二）载体载体的选择与构建的选择与构建 （三）（三）靶细胞靶细胞的选择的选择（四）（四）基因转移基因转移 （五）基因转染细胞的（五）基因转染细胞的筛选与鉴定筛选与鉴定（六）（六）回输体内回输体内 基因治疗的方式根据基因导入的方式分为两种：根据基因导入的方式分为两种：1.直接体内疗法（直接体内疗法（in vivo）是是指指将将目目的的基基因因直直接接导导入入体体内内有有关关的的组组织织器器官官，使其进入相应的细胞并进行表达。使其进入相应的细胞并进行表达。2.间接体内疗法（间接体内疗法（ex vivo）
21、是是指指在在体体外外将将目目的的基基因因导导入入靶靶细细胞胞，经经过过筛筛选选和和增增殖殖后后将将细细胞胞回回输输给给患患者者，使使该该基基因因在在体体内内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。基因治疗的种类基因治疗的种类生殖细胞生殖细胞基因治疗基因治疗 可遗传性可遗传性 伦理学问题伦理学问题 禁止应用人体禁止应用人体体细胞体细胞基因治疗：基因治疗：研究重点研究重点体细胞治疗体细胞治疗的概念的概念指指应应用用人人的的自自体体、同同种种异异体体或或异异种种（非非人人体体）的的体细胞体细胞；经经体外操作体外操作后。后。回输回输（或植入）人体的治疗方法。（或植入
22、）人体的治疗方法。（一）外源基因的选择与制备（一）外源基因的选择与制备 外源基因外源基因 目的基因：目的基因：与致病基因相对应的有功能的正常基因与致病基因相对应的有功能的正常基因 与致病基因无关、有治疗作用的基因与致病基因无关、有治疗作用的基因 标记基因标记基因:新霉素磷酸转移酶（新霉素磷酸转移酶（Neo）基因）基因外源基因的获得外源基因的获得 基因克隆基因克隆 人工合成人工合成 PCR扩增扩增 外源基因的选择原则外源基因的选择原则1.1.体内少量表达就可显著改善症状体内少量表达就可显著改善症状；2.2.过高表达不会对机体造成危害过高表达不会对机体造成危害；3.3.在在抗抗病病毒毒和和病病原原
23、体体的的基基因因治治疗疗中中，所所选选择择的的靶靶基基因因应应在在病病毒毒和和病病原原体体的的生生活活史史中中起起重重要要的的作作用用，并并且且该序列是特异的；该序列是特异的；4.4.肿肿瘤瘤病病人人多多有有免免疫疫缺缺陷陷，可可选选用用免免疫疫因因子子基基因因转转入入人人体体；可可采采用用反反义义技技术术封封闭闭细细胞胞内内活活化化的的癌癌基基因因或或向向细细胞胞内内转转入入野野生生型型抑抑癌癌基基因因，抑抑制制肿肿瘤瘤生生长长，所所针针对对的的癌癌基基因因或或抑抑癌癌基基因因应应与与该该肿肿瘤瘤的的发发生生和和发发展展有明确的相关性。有明确的相关性。（二）载体的选择与构建（二）载体的选择与
24、构建 病毒载体：病毒载体：逆转录病毒（逆转录病毒（RV)腺病毒（腺病毒（AV)腺相关病毒（腺相关病毒（AAV)单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（HSV)痘苗病毒（痘苗病毒（VV)非病毒载体：非病毒载体：脂质体法脂质体法 直接注射法直接注射法 受体介导基因转移受体介导基因转移 DNA-磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀 电穿孔电穿孔逆转录病毒结构逆转录病毒结构逆转录病毒的基因组结构逆转录病毒的基因组结构3LTR5LTRgag pol env 结构基因结构基因gag(group antigen)：编码核心蛋白和属特异性抗原：编码核心蛋白和属特异性抗原pol(polymerase)：编码逆转录酶编码逆转录酶env(
25、envelop)：编码编码病毒外壳蛋白和包膜蛋白病毒外壳蛋白和包膜蛋白LTR（long terminal repeat）序列）序列含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号逆转录病毒的生活史逆转录病毒的生活史逆转录病毒逆转录病毒宿主宿主细胞细胞病毒病毒RNAcDNA前前 病病 毒毒病毒病毒RNA包装蛋白包装蛋白包装包装成完整成完整的病毒颗粒的病毒颗粒出芽分泌出芽分泌子代病毒子代病毒感染其他感染其他细胞细胞整整 合合病毒载体构建病毒载体构建（1）去除去除病毒病毒致病性结构致病性结构的基因序列如逆转录的基因序列如逆转录病毒的病毒的gag、pol、env基因，从
26、结构上保证病基因，从结构上保证病毒的安全性。同时毒的安全性。同时产生的空白区以目的基因取产生的空白区以目的基因取而代之；而代之；（2）保留保留其基因的其基因的调控序列及包装序列调控序列及包装序列 等；等；（3）插入标记基因插入标记基因如如Neo基因以对基因转染细基因以对基因转染细胞的抗性筛选等。胞的抗性筛选等。包装细胞指指将将缺失缺失了了包装信号包装信号及相关序列的及相关序列的缺陷型逆转缺陷型逆转录病毒录病毒（辅助病毒辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成）导入哺乳细胞内而制备成的一种特殊的细胞系的一种特殊的细胞系.这种细胞因携带有完整这种细胞因携带有完整的病毒结构基因序列能够大量产生病毒包装蛋的病
27、毒结构基因序列能够大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（序列）序列）而不能包装而不能包装,不产生有复制能力的野生型病毒不产生有复制能力的野生型病毒颗粒。颗粒。假病毒颗粒假病毒颗粒当逆转录病毒载体转染进包装细胞后，转录出标记基当逆转录病毒载体转染进包装细胞后，转录出标记基因和目的基因的因和目的基因的RNA，含有两端的，含有两端的LTR和和包装信号包装信号，被包装细胞产生的病毒蛋白包装成病毒颗粒被包装细胞产生的病毒蛋白包装成病毒颗粒。因包装的因包装的RNA中不含病毒蛋白的编码序列，导致这种中不含病毒蛋白的编码序列，导致这种病毒只有病毒只有一次感染能力一次
28、感染能力，即在感染细胞后，不能产生，即在感染细胞后，不能产生新的病毒颗粒，称为新的病毒颗粒，称为假病毒颗粒假病毒颗粒。假病毒颗粒释放到包装细胞的培养液中，用于感染靶假病毒颗粒释放到包装细胞的培养液中，用于感染靶细胞，从而将其携带的治疗基因送入靶细胞。细胞，从而将其携带的治疗基因送入靶细胞。Vector DNAVector DNAHelper DNAHelper DNAEngineering a Virus into a VectorEngineering a Virus into a Vectorwildtype viruswildtype virusViral vectorViral vec
29、torreplicationreplicationreplicationreplicationproteinsproteinsproteinsproteinsstructuralstructuralproteinsproteinsPackagingPackagingTherapeutic geneTherapeutic geneessential viralessential viral genesgenesPackaging cellPackaging cellY YvectorvectorVector uncoatingVector uncoatingTherapeutic mRNAThe
30、rapeutic mRNAand proteinand proteinEpisomalEpisomalvectorvectorIntegrated Integrated expressionexpressionTarget cellTarget cellGene TransferGene TransferBased on Kay et al Based on Kay et al 20012001逆转录病毒载体的特点逆转录病毒载体的特点1.1.env env编码的糖蛋白结合细胞膜上的特异性受编码的糖蛋白结合细胞膜上的特异性受体，体，基因转移效率更高基因转移效率更高；2.2.结构基因结构基因gag
31、gag、envenv、polpol的缺失不影响其他的缺失不影响其他部分的活性；部分的活性；3.3.整合到靶细胞基因组，可整合到靶细胞基因组，可长期表达长期表达；4.4.包装好的假病毒颗粒分泌至包装细胞的培包装好的假病毒颗粒分泌至包装细胞的培养上清中，养上清中，易于分离制备易于分离制备。问题问题1.只能感染分裂期细胞只能感染分裂期细胞,靶细胞靶细胞DNA合成很活合成很活跃，跃，因为病毒感染和整合作用均依赖靶细胞因为病毒感染和整合作用均依赖靶细胞DNA的复制的复制；2.安全性安全性问题问题随机整合随机整合：诱发插入突变诱发插入突变，激活癌基因激活癌基因缺陷型逆转录病毒通过缺陷型逆转录病毒通过重组重
32、组获得复制能力获得复制能力腺病毒载体腺病毒载体1.基因组：基因组：双链无包膜双链无包膜DNA病毒病毒，36kb2.通过通过受体介导内吞作用受体介导内吞作用进入细胞，基因导入进入细胞，基因导入效率高。效率高。3.不整合不整合宿主基因组，安全。宿主基因组，安全。4.宿主细胞范围广泛。宿主细胞范围广泛。5.可口服、喷雾吸入或气管内滴注。可口服、喷雾吸入或气管内滴注。6.载体容量大。载体容量大。7.体外容易培养制备，病毒滴度较高。体外容易培养制备，病毒滴度较高。常用的病毒载体及其基因转移的特点常用的病毒载体及其基因转移的特点 逆转录病毒逆转录病毒 腺病毒腺病毒 腺相关病毒腺相关病毒 单纯疱疹病毒单纯疱
33、疹病毒 基因组基因组 正链正链RNA RNA 线性线性dsDNA dsDNA 线性线性ssDNA dsDNAssDNA dsDNA 8 811 kb 36 kb 4.7 kb 152 kb11 kb 36 kb 4.7 kb 152 kb外源基因容量外源基因容量 7 kb 7.5 kb 3.5 kb 30 kb 7 kb 7.5 kb 3.5 kb 30 kb 重组病毒滴度重组病毒滴度 中中 高高 较低较低 高高靶细胞状态靶细胞状态 分裂细胞，表面分裂细胞，表面 分裂细胞或分裂细胞或 分裂细胞或分裂细胞或 分裂细胞或分裂细胞或 须有特殊受体须有特殊受体 非分裂细胞非分裂细胞 非分裂细胞非分裂细
34、胞 非分裂细胞非分裂细胞基因转移效率基因转移效率 高高 高高 高高 高高 基因整合基因整合 随机整合随机整合 不整合不整合 定点整合于定点整合于 不整合不整合 染色体染色体19q19q外源基因表达状况外源基因表达状况 短暂短暂/稳定表达稳定表达 短暂表达短暂表达 稳定表达稳定表达 短暂短暂/稳定表达稳定表达安全性及其它安全性及其它 相对较安全相对较安全 可能引起炎症可能引起炎症 无病原性无病原性 可能出现毒性反应可能出现毒性反应 宿主范围广宿主范围广 和免疫反应和免疫反应 神经细胞嗜向性神经细胞嗜向性(三三)靶细胞的选择靶细胞的选择 生殖细胞生殖细胞:禁止禁止体细胞体细胞：淋巴细胞、造血细胞、
35、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肌肉细胞、内皮细胞、肌肉细胞、肝细胞、成纤维细胞肝细胞、成纤维细胞 肿瘤细胞等肿瘤细胞等 靶细胞的选择靶细胞的选择 可根据疾病的特点、目的基因及其转移的可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素来确定。方式等因素来确定。选择的原则：选择的原则：(1)(1)便于从体内取出和回输；便于从体内取出和回输；(2)(2)便于在体外培养与增殖；便于在体外培养与增殖；(3)(3)便于基因的高效转移；便于基因的高效转移；(4)(4)能够持续表达目的基因。能够持续表达目的基因。(四四)基因转移基因转移病毒法：病毒法：主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细主要通过携带有外源基因
36、的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。胞来实现基因的转移。非病毒法：非病毒法：物理方法物理方法DNADNA直接注射、显微注射、电穿孔、直接注射、显微注射、电穿孔、微粒轰击及基因枪技术等；微粒轰击及基因枪技术等；化学方法化学方法脂质体融合法、磷酸钙沉淀法、脂质体融合法、磷酸钙沉淀法、DEAE-DEAE-葡聚糖法等。葡聚糖法等。受体介导的内吞作用受体介导的内吞作用 脂质体脂质体 liposomes其基本原理是利用阳离子脂质体单体与其基本原理是利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质的脂质体，然后与细胞一起温育，即可通过细胞内体，然后与细胞一起
37、温育，即可通过细胞内吞作用将外源吞作用将外源DNA转移到细胞内。转移到细胞内。优势：使用方便、成本低廉。优势：使用方便、成本低廉。缺陷缺陷：转染效率较低转染效率较低和和转染基因表达时间短暂。转染基因表达时间短暂。(五五)基因转染细胞的筛选与鉴定基因转染细胞的筛选与鉴定抗性筛选方法：抗性筛选方法：重组载体上插入有标记基因重组载体上插入有标记基因Neo，导入受体细，导入受体细胞后可使其产生对胞后可使其产生对G418（Geneticin）药物的药物的抗性。在加入抗性。在加入G418的培养基中进行选择性培的培养基中进行选择性培养时，转染养时，转染NeoR基因的细胞能够存活，而未转基因的细胞能够存活，而
38、未转染的细胞则死亡；染的细胞则死亡；应用标记基因作为探针进行分子杂交法筛选。应用标记基因作为探针进行分子杂交法筛选。(五五)基因转染细胞的筛选与鉴定基因转染细胞的筛选与鉴定外源基因表达的鉴定：外源基因表达的鉴定：采用采用Northern印迹杂交印迹杂交：检测：检测mRNA的表达的表达 测定其表达产物即测定其表达产物即蛋白质的含量蛋白质的含量等方法。等方法。动物实验动物实验(六六)回输体内回输体内方式：方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等 基因修饰的淋巴细胞以基因修饰的淋巴细胞以静脉注射静脉注射的方式回输到血的方式回输到血液中；液中；将皮肤成纤维细胞以将皮肤成纤
39、维细胞以细胞胶原悬液注射细胞胶原悬液注射至患者皮至患者皮下组织；下组织；采用采用自体骨髓移植自体骨髓移植的方法输入造血细胞；的方法输入造血细胞；或以或以导管技术导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。将血管内皮细胞定位输入血管等。第一军医大学分子生物学研究所第一军医大学分子生物学研究所四、基因治疗的应用四、基因治疗的应用与展望与展望基因治疗的应用基因治疗的应用遗传病遗传病 替补法，导入正常基因替补法，导入正常基因病毒性疾病病毒性疾病 阻断病毒基因在体内的转录和翻译阻断病毒基因在体内的转录和翻译肿瘤肿瘤 基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因疗法疗法遗传病的基
40、因治疗遗传病的基因治疗1 1）在）在DNADNA水平水平明确其发病原因及机制明确其发病原因及机制；2 2）隐性遗传的单基因遗传病隐性遗传的单基因遗传病；3 3）该基因的）该基因的表达不需要精确调控表达不需要精确调控；4)4)该基因能在一种该基因能在一种便于临床操作便于临床操作的组织细胞的组织细胞中表达并发挥生理作用；中表达并发挥生理作用；5 5）该遗传病）该遗传病不经治疗将有严重后果不经治疗将有严重后果。遗传病基因治疗的临床研究遗传病基因治疗的临床研究1.腺苷脱氨酶（腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症）缺乏症2.家族性高胆固醇血症（家族性高胆固醇血症（FH）3.囊性纤维变性（囊性纤维变性（CF）4.粘
41、多糖沉积症粘多糖沉积症5.血友病血友病B（凝血因子（凝血因子IX缺乏）缺乏）“先天性重症联合免疫缺陷综合征先天性重症联合免疫缺陷综合征”(SCID)(SCID)Ashanti De Silva was the first patient to be treated with gene therapy in 1990.She received infusions of T cells that had been transduced with a gene for ADA(an enzyme that she lacks)ADAADA缺陷病的分子机制缺陷病的分子机制腺苷脱氨酶（腺苷脱氨酶（ADA
42、ADA）催化腺嘌呤核苷（）催化腺嘌呤核苷（A A）和脱）和脱氧腺嘌呤核苷（氧腺嘌呤核苷（dAdA）脱氨，生成次黄嘌呤核苷）脱氨，生成次黄嘌呤核苷和脱氧次黄嘌呤核苷。和脱氧次黄嘌呤核苷。ADAADA缺陷缺陷 脱氧腺嘌呤核苷酸代谢受阻脱氧腺嘌呤核苷酸代谢受阻 dATPdATP 抑制核糖核苷还原酶活性抑制核糖核苷还原酶活性 阻止阻止DNADNA复制和修复复制和修复 导致细胞死亡，对导致细胞死亡，对淋巴细淋巴细胞胞毒性最强。毒性最强。1 1）单个核细胞的分离单个核细胞的分离：使用淋巴细胞分层液：使用淋巴细胞分层液分离患儿血中单个核细胞；分离患儿血中单个核细胞；2 2）单个核细胞培养：）单个核细胞培养：
43、以以“CD3CD3抗体抗体 +IL2+IL2”体外培养以体外培养以刺激刺激T T细胞增殖细胞增殖，分化；，分化；3 3）逆转录病毒载体介导）逆转录病毒载体介导外源基因外源基因（治疗基因（治疗基因 +标志基因）标志基因）转染转染T T细胞细胞；4 4）将转染细胞）将转染细胞回输回输给患儿体内。给患儿体内。ADA基因治疗方案基因治疗方案肿瘤的基因治疗策略肿瘤的基因治疗策略一、一、抑制和杀伤肿瘤细胞抑制和杀伤肿瘤细胞 1.自杀基因疗法（自杀基因疗法（tk、CD基因基因）2.抑制癌基因的表达抑制癌基因的表达 （反义反义RNA、核酶核酶、细胞内抗体细胞内抗体）3.恢复抑癌基因的功能（恢复抑癌基因的功能（
44、p53、Rb基因基因）4.抗肿瘤血管形成抗肿瘤血管形成肿瘤的基因治疗策略肿瘤的基因治疗策略二、二、肿瘤细胞的基因肿瘤细胞的基因“修饰修饰”1.导入细胞因子基因导入细胞因子基因 2.导入导入MHC基因和共刺激分子基因基因和共刺激分子基因三、调节和增强机体的免疫功能三、调节和增强机体的免疫功能 1.1.细胞因子基因导入免疫细胞细胞因子基因导入免疫细胞 2.2.基因修饰的树突状细胞基因修饰的树突状细胞 3.3.分泌免疫毒素的分泌免疫毒素的T T淋巴细胞淋巴细胞 4.4.肿瘤肿瘤DNADNA疫苗疫苗肿瘤的基因治疗策略肿瘤的基因治疗策略肿瘤基因治疗临床试验方案肿瘤基因治疗临床试验方案黑色素瘤黑色素瘤83
45、83前列腺癌前列腺癌4444乳腺癌乳腺癌3232间质瘤间质瘤3 3卵巢癌卵巢癌3131头颈部癌症头颈部癌症3131胶质瘤胶质瘤2828结肠癌结肠癌2525肺癌肺癌2626胰腺癌胰腺癌3 3肾癌肾癌2121膀胱癌膀胱癌2 2成神经细胞瘤成神经细胞瘤7 7子宫颈癌子宫颈癌6 6病毒病毒性疾病的基因治疗性疾病的基因治疗针对病毒针对病毒:1.诱导对病毒诱导对病毒RNA的降解的降解2.抑制病毒与宿主细胞结合抑制病毒与宿主细胞结合3.干扰病毒基因组的转录起始和调控干扰病毒基因组的转录起始和调控4.抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成5.RNA干扰技术干扰技术中国的基因治疗中国的
46、基因治疗1991.12 血友病血友病B，凝血因子，凝血因子IX，逆转录病毒载，逆转录病毒载体，导入患者自身皮肤成纤维细胞。体，导入患者自身皮肤成纤维细胞。恶性脑胶质瘤，恶性脑胶质瘤，TKTK基因基因非小细胞肺癌，逆转录病毒，非小细胞肺癌，逆转录病毒，IL-2基因治疗药物基因治疗药物20032003年年1010月月1616日，拥有自主知识产权的重组日，拥有自主知识产权的重组人人p53p53腺病毒注射液腺病毒注射液(Gendicine)(Gendicine)获得国家食获得国家食品药品监督管理局批准的新药证书。品药品监督管理局批准的新药证书。这是世界上第一个获得正式批准的基因治疗这是世界上第一个获得
47、正式批准的基因治疗药物。药物。基因治疗存在的问题基因治疗存在的问题三个关键问题：三个关键问题：构建高效、靶向性基因转移系统构建高效、靶向性基因转移系统 发现切实有效的治疗基因发现切实有效的治疗基因 外源基因表达的调控外源基因表达的调控一个需要重视的问题：一个需要重视的问题：外源基因的导入对机体带来的不利影响外源基因的导入对机体带来的不利影响 l19991999年年“杰辛格杰辛格”基因疗法基因疗法失败失败.l1818岁的泽西岁的泽西杰辛格患有鸟杰辛格患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)(OTC)缺失症，接受基因疗法后意缺失症，接受基因疗法后意外死亡外死亡。现状及展望现状及展望基因
48、治疗现阶段仅仅是实验性地运用于经过其基因治疗现阶段仅仅是实验性地运用于经过其他治疗无效的他治疗无效的“绝症绝症”；酶及药物性的化学疗法，以及骨髓、器官移植酶及药物性的化学疗法，以及骨髓、器官移植仍然是当前治疗多种遗传病的最有效手段；仍然是当前治疗多种遗传病的最有效手段；癌症的治疗仍以手术切除及化疗为主。癌症的治疗仍以手术切除及化疗为主。道路曲折，前途光明道路曲折，前途光明本章小结本章小结基因治疗：基因治疗：指将外源基因转移至患者细胞内并有效适度表达，以达指将外源基因转移至患者细胞内并有效适度表达，以达到治疗疾病的目的。到治疗疾病的目的。基因治疗策略：基因治疗策略：(1)(1)直接策略：直接策略
49、：基因矫正、基因置换、基因增补、基因干预；基因矫正、基因置换、基因增补、基因干预；(2)(2)间接策略：间接策略：免疫基因治疗、分子化疗、特异性细胞杀伤等。免疫基因治疗、分子化疗、特异性细胞杀伤等。本章小结本章小结基因治疗方式基因治疗方式：直接体内疗法和间接体内疗法两种。直接体内疗法和间接体内疗法两种。基本流程：基本流程：外源基因的选择与制备、表达载体的选择与构建、靶外源基因的选择与制备、表达载体的选择与构建、靶细胞的选择，基因转移，基因转染细胞的筛选与鉴定，细胞的选择，基因转移，基因转染细胞的筛选与鉴定，回输体内。回输体内。基因治疗在遗传性疾病、肿瘤、心血管疾病、感染性基因治疗在遗传性疾病、肿瘤、心血管疾病、感染性疾病以及神经系统疾病等的治疗中具有诱人的前景。疾病以及神经系统疾病等的治疗中具有诱人的前景。思思 考考 题题肿瘤的基因治疗包括哪些基本策略？肿瘤的基因治疗包括哪些基本策略？以逆转录病毒载体进行以逆转录病毒载体进行ex vivoex vivo基因治疗为例，基因治疗为例，试述其技术原理及基本过程。试述其技术原理及基本过程。针对目前存在的问题，该怎样看待基因治疗的针对目前存在的问题，该怎样看待基因治疗的现状及发展前景？现状及发展前景？