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1、第二章 分子克隆常用工具酶 田振东田振东TTel:87286939Office:园林楼园林楼620 每一单链具有每一单链具有 5 5-3-3极性极性 两条单链间以氢键连接两条单链间以氢键连接 两条单链，极性相反，反向平行两条单链，极性相反，反向平行 以中心为轴，向右盘旋以中心为轴，向右盘旋Structure and featuresDNA 的基本结构的基本结构Replication分子克隆操作过程：克隆目的基因将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成重组DNA导入宿主细胞筛选、鉴定扩增和表达。工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。要把不
2、同基因的DNA线形分子片段准确地切出来，需 要 各 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要 DNA 聚合酶（polymerase）等。因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。核酸水解酶类核酸水解酶类核酸水解酶类核酸水解酶类核酸合成酶类核酸合成酶类核酸合成酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸修饰酶类核酸修饰酶类核酸修饰酶类核酸内切酶核酸内切酶核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶RNARNA聚合酶聚合
3、酶聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶磷酸酶磷酸酶磷酸酶磷酸酶核苷酸激酶核苷酸激酶核苷酸激酶核苷酸激酶核苷酸转移酶核苷酸转移酶核苷酸转移酶核苷酸转移酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶核酸酶核酸酶核酸修饰酶核酸修饰酶用于核酸操作的常用工具酶用于核酸操作的常用工具酶工具工具酶酶名称名称 主要功能限制性内切核酸限制性内切核酸酶酶Restrictionendonucleases在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割DNA连连接接酶酶DNAligase将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接
4、成一个整体DNA聚合聚合酶酶IDNApolymeraseI通过向 3 端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂口，即53 DNA 聚合酶活性与 35及53-外切酶活性多核苷酸激多核苷酸激酶酶DNApolymerasekinease催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5-OH末端上反反转录转录酶酶Reversetranscriptase以RNA分子为模板合成互补的cDNA链DNA末端末端转转移移酶酶DNAterminaltransferase将同聚物尾巴加到线性双链 或单链DNA分子的3-OH末端或DNA的3-末端标记dNTP降解降解酶酶S1nucleaseS1降解单链DNA或RNA，产生
5、带5磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链TaqDNA聚合聚合酶酶TaqDNApolymerase能在高温（72）下的单链DNA为模板，从53方向合成新生的互补链常用的工具酶性质及功能第一第一节节分子克隆最常用两个工具分子克隆最常用两个工具酶酶“分子分子分子分子剪刀剪刀剪刀剪刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 在在在在DNADNADNADNA上核苷酸的特上核苷酸的特上核苷酸的特上核苷酸的特定连接处以特定的方式把定连接处以特定的方式把定连接处以特定的方式把定连接处以特定的方式把DNADNADNADNA双链切开。如双链切开。如双链切开。如双链切
6、开。如EcoRI,EcoRI,EcoRI,EcoRI,HpaIHpaIHpaIHpaI“分子胶分子胶分子胶分子胶”DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶促使具有互补粘性末端或平头促使具有互补粘性末端或平头促使具有互补粘性末端或平头促使具有互补粘性末端或平头末端的载体和供体末端的载体和供体末端的载体和供体末端的载体和供体DNADNADNADNA片段连接，形成重组片段连接，形成重组片段连接，形成重组片段连接，形成重组DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。限制性内切酶限制性内切酶 Restrictionenzymes“分子分子分子分子剪刀剪刀剪刀剪刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内
7、切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 在在在在DNADNADNADNA上核苷酸的特上核苷酸的特上核苷酸的特上核苷酸的特定连接处以特定的方式把定连接处以特定的方式把定连接处以特定的方式把定连接处以特定的方式把DNADNADNADNA双链切开。如双链切开。如双链切开。如双链切开。如EcoRI,EcoRI,EcoRI,EcoRI,HpaIHpaIHpaIHpaI 限制性内切酶是一种能识别 DNA 上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一种内切核酸酶。一、一、限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶的分类分类二、二、限制性核酸内切酶的命名原则限制性核酸内切酶的命名原则名名名名属
8、属属属种种种种株株株株序序序序菌株来源菌株来源菌株来源菌株来源称称称称名名名名名名名名名名名名号号号号EcoREcoREcoREcoREscherichia coli REscherichia coli R Hind Hind HindHindHaemophilus influenzae dHaemophilus influenzae dHindHindHindHindHaemophilus influenzae dHaemophilus influenzae dHpaHpaHpa/Hpa/Haemophilus parainfluenzaeaHaemophilus parainfluenza
9、eaHinHind d 代表从流感噬血杆菌代表从流感噬血杆菌代表从流感噬血杆菌代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae)d)d 株中株中株中株中分离到的第分离到的第分离到的第分离到的第3 3个限制酶。个限制酶。个限制酶。个限制酶。一般分子量为一般分子量为60kd60kd，单链多肽，最适，单链多肽，最适 pH pH 为为 6 68 8 NaCl NaCl有抑制作用，能被有抑制作用，能被Mg2+Mg2+激活，巯基有保护作用激活，巯基有保护作用 对热不稳定，通常贮存于对热不稳定，通常贮存于2020环境。为避免反复环境。为避免反复冻溶
10、使酶失活，商品酶均含有冻溶使酶失活，商品酶均含有5050甘油，使用时添加甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。三、限制性核酸内切酶学特性三、限制性核酸内切酶学特性每一种酶都有各自每一种酶都有各自特异识别位点特异识别位点 它对底物要求有特异它对底物要求有特异的序列，通常的识别序列的序列，通常的识别序列是是4 bp 6bp，有些则，有些则为为7bp8bp，甚或多于，甚或多于8bp。多数限制酶的识别序多数限制酶的识别序列为回文结构，在识别序列为回文结构，在识别序列内或其附近水解列内或其附近水解DNA链链中的磷酸二酯键。中的磷酸二酯键。不同
11、限制性内切酶切割的三种结果不同限制性内切酶切割的三种结果5-5-GGATCC-3GGATCC-33-CCTAGG-53-CCTAGG-55-5-GGATCC-3GGATCC-33-CCTAGG-53-CCTAGG-55-5-AGATCT-3AGATCT-33-TCTAGA-53-TCTAGA-55-5-AGATCT-3AGATCT-33-TCTAGA-53-TCTAGA-5Bgl IIBgl IIBam HBam H同尾酶同尾酶 温度：一般温度：一般3737 盐离子浓度：盐离子浓度：NaNa，Mg2Mg2 缓冲体系：具有稳定缓冲体系：具有稳定 pH pH 环境的环境的Tris-HClTris-
12、HCl缓冲体系缓冲体系 DTTDTT用于保持酶用于保持酶 稳定性和活性稳定性和活性 反应体积和甘油浓度：反应体积和甘油浓度：商商品品化化的的限限制制性性内内切切核核酸酸酶酶均均加加5050甘甘油油作作为为保保护护剂剂，一一般般在在-20-20保保存存。酶酶切切反反应应时时，加加酶酶的的体体积积一一般般不不超超过过总总反反应应的的1010，否否则则甘甘油油浓浓度度过高，影响酶切反应过高，影响酶切反应 反应时间：反应时间：通常为通常为1 1h h；进行大量进行大量DNADNA酶切反应时一般让酶解过夜酶切反应时一般让酶解过夜 DNADNA纯度和结构纯度和结构 DNADNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂
13、、样品中所含的蛋白质、有机溶剂、RNARNA等杂质会影等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNADNA，DNADNA的甲基化位的甲基化位置会影响酶切反应。置会影响酶切反应。四、影响酶切反应的条件*II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系型限制性核酸内切酶酶解反应体系“星”活性Star activity“星星”活活性性：高高浓浓度度的的酶酶、高高浓浓度度的的甘甘油油、低低离离子子强强度度、极极端端ppH值值等等，会会使使一一些些核核酸酸内内切切酶酶的的识别识别和切割序列和切割序列发发生低特异性所生低特异性所谓谓的的现现象。象。在在名名
14、称称右右上上角角加加一一个个星星号号(*)表表示示,如如EcoR*：AATT；EcoR：GAATTC必必须须采用采用规规范的范的实验实验步步骤骤,应应用推荐的反用推荐的反应应条件。条件。位点偏爱（位点偏爱（sitepreference）某些限制性内切酶对不同位置的某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割同一个识别序列表现出不同的切割效率。效率。第二节第二节DNA连接酶连接酶DNALigase定义：定义：定义：定义：催化催化催化催化DNADNADNADNA上裂口两侧上裂口两侧上裂口两侧上裂口两侧(相邻相邻相邻相邻)核苷酸裸露的核苷酸裸露的核苷酸裸露的核苷酸裸露的3 3 3 3羟
15、基和羟基和羟基和羟基和5 5 5 5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的键，使断开的键，使断开的键，使断开的DNADNADNADNA裂口连接起来裂口连接起来裂口连接起来裂口连接起来功能：功能：功能：功能：具有修复单链或双链的能力具有修复单链或双链的能力具有修复单链或双链的能力具有修复单链或双链的能力,在在在在DNADNADNADNA重组、重组、重组、重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。复制和损伤后的修复中都起关键作用。复制和损伤后的修复中都起关键作用。复制和损伤后的修复中都起关键作用。一、一、D
16、NA连接酶性质连接酶性质T4DNAligaseE.coliDNAligase来源来源T4噬菌体噬菌体大大肠肠杆菌杆菌分子量分子量6000075000辅辅助因子助因子ATPNAD+底物底物双双链链DNA分子的粘、平端分子的粘、平端RNA-DNA杂杂合体，合体，RNA链链缺口、双缺口、双链链DNA分子中的分子中的单单链链缺口缺口同源互同源互补补粘端粘端双双链链分子中的分子中的单链单链缺口缺口应应用范用范围围广泛、效率高广泛、效率高窄窄两种DNA连接酶比较 二、常用连接酶二、常用连接酶vv连接反应的温度连接反应的温度连接反应的温度连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。是影响转化效率的最重要参数。
17、是影响转化效率的最重要参数。是影响转化效率的最重要参数。多数多数多数多数内切酶产生的粘性末端的内切酶产生的粘性末端的内切酶产生的粘性末端的内切酶产生的粘性末端的TmTmTmTm值在值在值在值在15151515以下，然而保持以下，然而保持以下，然而保持以下，然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是连接酶活性的最佳反应温度却是连接酶活性的最佳反应温度却是连接酶活性的最佳反应温度却是37373737但在该温度下，但在该温度下，但在该温度下，但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳粘性末端之间的氢键结合是不稳粘性末端之间的氢键结合是不稳粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，定的，定的，定的，因此最适温度是粘
18、性末端的因此最适温度是粘性末端的因此最适温度是粘性末端的因此最适温度是粘性末端的TmTmTmTm值和连接酶最适值和连接酶最适值和连接酶最适值和连接酶最适温度的折衷，温度的折衷，温度的折衷，温度的折衷，所以连接反应一般采用所以连接反应一般采用所以连接反应一般采用所以连接反应一般采用16161616过夜。过夜。过夜。过夜。三、三、DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件DNADNADNADNA浓度：浓度：浓度：浓度：外源片段浓度比载体外源片段浓度比载体外源片段浓度比载体外源片段浓度比载体DNADNADNADNA浓度高浓度高浓度高浓度高5-105-105-105-10倍倍倍倍 由于由于由于由于平末端的
19、连接效率比粘性末端要低得多平末端的连接效率比粘性末端要低得多平末端的连接效率比粘性末端要低得多平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故在，故在，故在，故在平末端连接反应中，平末端连接反应中，平末端连接反应中，平末端连接反应中，T4 DNAT4 DNAT4 DNAT4 DNA连接酶的浓度和外源连接酶的浓度和外源连接酶的浓度和外源连接酶的浓度和外源DNADNADNADNA及及及及载体载体载体载体DNADNADNADNA浓度均要求较高。浓度均要求较高。浓度均要求较高。浓度均要求较高。防止环化：防止环化：防止环化：防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体碱性磷酸酶预先处理质粒载体碱性磷酸酶预先处理质粒载体碱
20、性磷酸酶预先处理质粒载体时间：时间：时间：时间：过夜最好过夜最好过夜最好过夜最好1 1）粘性末端）粘性末端DNADNA片段的连接片段的连接a.a.直接用直接用T4 DNAT4 DNA连接酶连接连接酶连接：效率不高，较少采用。：效率不高，较少采用。b.b.同同聚聚物物加加尾尾连连接接平平末末端端DNADNA片片段段：先先用用末末端端核核苷苷酸酸转转移移酶酶，给给平平末末端端DNADNA分分子子加加上上同同聚聚物物尾尾巴巴后后再再用用DNADNA连接酶进行连接连接酶进行连接c.c.用用衔衔接接物物连连接接平平末末端端DNADNA分分子子：目目的的是是在在平平末末端端分分子子上上构构建建限限制制性性
21、核核酸酸内内切切酶酶酶酶切切位位点点，经经酶酶切切后后产产生生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNADNA连接连接2)平末端DNA片段的连接应用互补同聚物加尾法连接应用互补同聚物加尾法连接应用互补同聚物加尾法连接应用互补同聚物加尾法连接DNADNADNADNA片段片段片段片段用衔接物分子连接平末端的用衔接物分子连接平末端的用衔接物分子连接平末端的用衔接物分子连接平末端的DNADNADNADNA片段片段片段片段四、重组四、重组DNA实验的一般程序实验的一般程序a.a.选用一种对载体选用一种对载体DNADNA只具唯一限制识别位点的限制酶只具唯一限制识别位点的
22、限制酶（如（如EcoR IEcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性作位点特异的切割，形成全长的具粘性末端的线性末端的线性DNADNA分子分子b.b.再将外源再将外源DNADNA片段也用同一种酶作相同的消化。片段也用同一种酶作相同的消化。c.c.混合，加入混合，加入DNADNA连接酶。由于具有相同的（如连接酶。由于具有相同的（如EcoR EcoR I I）粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经口经DNADNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNADNA分子。分子。第二节第二节 其他分子克隆工具酶其他分子克隆
23、工具酶一、DNA 聚合酶1.1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I2.2.K1enowK1enow片段片段3.3.T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶4.4.Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶5.5.逆转录酶逆转录酶：依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶6.6.RNARNA聚合酶聚合酶依赖于依赖于依赖于依赖于DNADNADNADNA的的的的DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 用途：用途：用途：用途：DNADNADNADNA缺口平移中标记缺口平移中标记缺口平移中标记缺口平移中标记DNADNADNADNA探针探针探针探针大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚
24、合酶聚合酶I I 以一条以一条以一条以一条DNADNADNADNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链双链双链双链DNADNADNADNA分子的分子的分子的分子的 3 3 3 3-OH OH OH OH 端而合成新的端而合成新的端而合成新的端而合成新的 DNA.DNA.DNA.DNA.基本用途基本用途 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment)大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I经枯草杆菌蛋白酶处理经枯草杆菌蛋白酶处理,获得获得N N端三分之二的大肽段端三分之二
25、的大肽段,即即Klenow Klenow 酶。酶。Klenow Klenow 酶仍拥有酶仍拥有5353的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性和和3535的核酸外切酶活性，但失去了的核酸外切酶活性，但失去了5 5 33的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。有有35的核酸外切酶活性和的核酸外切酶活性和 53的的DNA聚合酶活性。聚合酶活性。在无在无dNTP时，可以从任何时，可以从任何 3-OH端外切端外切 T4 DNA T4 DNA 聚合酶聚合酶 (T4 phage DNA polymerase)基本用途基本用途TaqTaqTaqTaq DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶是是是是从从从从
26、栖栖栖栖热热热热水水水水生生生生菌菌菌菌(Thermus(Thermus(Thermus(Thermus aquaticus)aquaticus)aquaticus)aquaticus)中中中中分分分分离纯化的依赖离纯化的依赖离纯化的依赖离纯化的依赖DNADNADNADNA的的的的DNADNADNADNA聚合酶，最适温度聚合酶，最适温度聚合酶，最适温度聚合酶，最适温度75-8075-8075-8075-80需需需需要要要要MgMgMgMg2+2+2+2+(10(10(10(10 mmolmmolmmolmmolL)L)L)L)，在在在在低低低低浓浓浓浓度度度度MnMnMnMn2+2+2+2+(
27、2(2(2(2 mmol/L)mmol/L)mmol/L)mmol/L)中中中中有有有有低低低低活活活活性性性性，CaCaCaCa2+2+2+2+使使使使其其其其完完完完全全全全失失失失活活活活，一一一一价价价价阳阳阳阳离离离离子子子子高高高高至至至至0.1 0.1 0.1 0.1 moImoImoImoIL L L L对对对对活活活活性性性性无无无无影影影影响响响响，而而而而最最最最适适适适浓浓浓浓度度度度NaClNaClNaClNaCl为为为为40 40 40 40 mmol/Lmmol/Lmmol/Lmmol/L，KClKClKClKCl为为为为60 60 60 60 mmol/Lmmo
28、l/Lmmol/Lmmol/L最最最最适适适适pH7.8(Tris-HCl)pH7.8(Tris-HCl)pH7.8(Tris-HCl)pH7.8(Tris-HCl)，与与与与大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶相相相相比比比比，其其其其最大特性是最大特性是最大特性是最大特性是耐高温和无核酸酶活性耐高温和无核酸酶活性耐高温和无核酸酶活性耐高温和无核酸酶活性Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶催化催化催化催化RNARNARNARNA体外合成反应体外合成反应体外合成反应体外合成反应依赖依赖依赖依赖 DNA DNA DNA DNA 的的的的 RNA R
29、NA RNA RNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶不依赖不依赖不依赖不依赖 DNA DNA DNA DNA 的的的的RNARNARNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 RNARNA聚合酶聚合酶 反转录酶反转录酶(reverse transcriptase)反转录酶具有反转录酶具有反转录酶具有反转录酶具有5 5 5 53333 的的的的DNADNADNADNA聚合酶活性，聚合酶活性，聚合酶活性，聚合酶活性，以以以以RNARNARNARNA为模板为模板为模板为模板聚合聚合聚合聚合cDNAcDNAcDNAcDNA链链链链,同时又具有同时又具有同时又具有同时又具有3 3 3 3 5555 和和和和5 5 5
30、 5 3333 的的的的 RNA RNA RNA RNA 外切核酸外切核酸外切核酸外切核酸酶活性酶活性酶活性酶活性。AMVAMVAMVAMV和和和和MLVMLVMLVMLV。主要用途：转录主要用途：转录 mRNA mRNA 成为成为 cDNA cDNA 制备基因片段制备基因片段双向外切双向外切DNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNA链链DNA 和 RNA的修饰酶1.1.核酸酶核酸酶SISI2.2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶3.3.磷酸激酶磷酸激酶4.4.末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶5.5.甲基化酶甲基化酶1）单链核酸酶SI 功能：功能：降解降解ssDNA或或ssRNA形成形成5-磷酸末端
31、的磷酸末端的单单或寡核苷酸片段。或寡核苷酸片段。应用：应用：1)1)分析分析DNADNA：RNARNA杂交体结构（杂交体结构（S1 mappingS1 mapping）。确定内）。确定内含子部位。含子部位。2)2)切除切除DNADNA片段上的单链末端，形成平末端片段上的单链末端，形成平末端.3)3)切开切开 cDNA cDNA 合成过程中形成的发夹环合成过程中形成的发夹环4)4)在限制酶位点上产生小缺失在限制酶位点上产生小缺失Rnase和和 DNaseRNase-Free DNase 是一种DNase I（核酸内切酶），可以降解双链或单链 DNA。RNase H：特异性地水解杂交到 DNA 链
32、上的 RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。RNase A：广泛应用的核酸内切酶。对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。Rnase 酶非常稳定，常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。DEPC 处理。碱性磷酸酶 功能：功能：催化去除催化去除DNA、RNA上的上的5端磷酸端磷酸基基团团,从从DNA片段上除去片段上除去5磷酸以防自身磷酸以防自身连连接。接。用途：用途：在在DNA连连接之前常用它接之前常用它处处理克隆理克隆载载体体以防止以防止载载体自身体自身连连接。接。CalfIntestinalAlkalinePh
33、osphatase(CIAP)磷酸激酶磷酸激酶T4-多核苷酸磷酸激酶多核苷酸磷酸激酶末端脱氧核苷酸转移酶 功能：功能：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，沿着沿着55到到 3 3加到加到 DNA DNA 链的链的 3 3-OH OH 末端。末端。该过程不该过程不需要需要DNADNA模板模板，对双链、单链，对双链、单链 DNA DNA 都适用。经常用于人都适用。经常用于人工粘性末端的构建。工粘性末端的构建。末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)TDT)TDT)TDT)甲基化酶原核生物甲基化酶是作为
34、限制与修饰系统中的一员，原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。不被相应的限制酶所切割。Dam 甲基化酶可在甲基化酶可在 GAmTC 序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤 N6 位位置上引入甲基。受其影响的酶有置上引入甲基。受其影响的酶有Bccll II、MbbooII等。等。Dcm 甲基化酶识别甲基化酶识别 CCmAGG 或或 CCmTGG 序列，序列，在第二个胞嘧啶在第二个胞嘧啶 C 的的 C5 位置上引入甲基。位置上引入甲基。受其影响的酶有EccooR IIII等基因工程中常用的工具酶基因工程中常用的工具酶工工工工 具具具具 酶酶酶
35、酶功功功功 能能能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNADNADNADNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶催化催化催化催化DNADNADNADNA中相邻的中相邻的中相邻的中相邻的5 5 5 5 磷酸基和磷酸基和磷酸基和磷酸基和3 3 3 3 羟基末端之间形成磷酸二酯键，使羟基末端之间形成磷酸二酯键，使羟基末端之间形成磷酸二酯键，使羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNADNADNADNA切切切切口封合或使两个口封合或使两个口封合或使两个口封合或使两个DNADNADNADNA分子
36、或片段连接分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶合成双链合成双链合成双链合成双链cDNAcDNAcDNAcDNA分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNADNADNADNA序列分析序列分析序列分析序列分析填补填补填补填补3 3 3 3 末端末端末端末端KlenowKlenowKlenowKlenow片段片段片段片段DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I I I大片段大片段大片段大片段具有完整具有完整具有完整具有完整DNA
37、DNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I I I的的的的5 5 5 53 3 3 3 聚合、聚合、聚合、聚合、3 3 3 35 5 5 5 外切活性，而无外切活性，而无外切活性，而无外切活性，而无5 5 5 53 3 3 3 外切活性。常用于外切活性。常用于外切活性。常用于外切活性。常用于cDNAcDNAcDNAcDNA第二链合成，双链第二链合成，双链第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3DNA 3DNA 3DNA 3 末端标记等末端标记等末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶合成合成合成合成cDNAcDNAcDNAcDNA替代替代替代替代DNADNADNADNA聚合
38、酶聚合酶聚合酶聚合酶I I I I进行填补，标记或进行填补，标记或进行填补，标记或进行填补，标记或DNADNADNADNA序列分析序列分析序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 5 5 5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶在在在在3 3 3 3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末
39、端磷酸基切除末端磷酸基切除末端磷酸基切除末端磷酸基思考题：思考题：u载体构建的工具酶主要有那些类型？u限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制与修饰。核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响其酶活性的因素。uT4 DNA连接酶的性质及用途.uKlenow 酶的基本性质及用途。u其他工具酶的用途。练练 习习 题题1.一种一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：EcoRI5kbEcoRI/HindIII1、2、3、4kbHindIII3kb、7kbEcoRI/PstI2、3、5kbPstI10kbHindIII/PstI1、3、6k
40、b将各限制酶位点绘制在将各限制酶位点绘制在DNA分子上。分子上。2.另一另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。分子上。EcoRI1、3、6kbEcoRI/HindIII1、3kbHindIII4、6kbEcoRI/PstI1、3、5kbPstI2、8kbHindIII/PstI2、6kb3.下图中的一段下图中的一段DNA分子上有两个限制酶分子上有两个限制酶PstI和和EcoRI识别位点，识别位点，两位点相距两位点相距10bp，现有一研究生要分析，现有一研究生要分析EcoRI右侧右侧500bp区域内区域内的功能，他需要
41、在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定区，他应如何设计此实验？假定EcoRIPstI间的间的10bp除去后并除去后并不影响任何结果分析，但不影响任何结果分析，但PstI位点左侧的位点左侧的DNA不能除去不能除去10bp 500bp PstI EcoRI4.假如假如PstI位点为另一限制酶位点为另一限制酶HindIII，实验又该如何设计？，实验又该如何设计？5.现有一研究者打算将一现有一研究者打算将一EcoRIDNA片段克隆到一个片段克隆到一个DNA分子分子的的BamHI位点以便位点以便DNA扩增，但扩增后的
42、扩增，但扩增后的DNA分子又可用分子又可用BamHI限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。6.一研究生要将一质粒（一研究生要将一质粒（pI）上的）上的BamHI-HindIII片段取代另一片段取代另一质粒（质粒（pII）上的）上的BamHI-XbaI片段，所获重组质粒（片段，所获重组质粒（pIII）上）上的插入片段要求能用的插入片段要求能用BamHI-HindIII进行回收，问如何设计此进行回收，问如何设计此实验？实验？10bp 500bp HindIII EcoRI H Xb H5kb pI 1kb 6kb pII .5kb 6kb pIII 1kb
43、 B B B 7.现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示：现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示：已知已知HinHindIIIdIII克隆片段中的克隆片段中的BamBamHIHI（3kb3kb）片段含有一完整的基）片段含有一完整的基因编码区，现要将此因编码区，现要将此3kb3kb的的BamBamHIHI片段克隆到另一表达载体片段克隆到另一表达载体pBpB的的BamBamHIHI位点，如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相位点，如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是相同的？同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是
44、相同的？HindIII PstIBamHI PstI BamHIBamHI HindIIIpA 8kb pB0.5 2.58.为了检测绿豆核酸酶对为了检测绿豆核酸酶对5-端突起的单链端突起的单链DNA切割是否准确有效，切割是否准确有效，即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常精巧的实验，其中一个实验是将一精巧的实验，其中一个实验是将一XbaI片段插入片段插入pBR322的的Apr基基因内的因内的ScaI位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿豆核位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿豆核酸酶的作用确实与预期的结果一致
45、，你能否设计出这一套实验？酸酶的作用确实与预期的结果一致，你能否设计出这一套实验？(pBR322除含有除含有Apr基因外，还含有基因外，还含有Tcr基因基因)。9.某研究者计划将具有限制酶某研究者计划将具有限制酶BamHI粘性末端结构的一段低聚核粘性末端结构的一段低聚核苷酸分子插入到一载体的克隆位点区。现假设他已获得具有低聚苷酸分子插入到一载体的克隆位点区。现假设他已获得具有低聚核苷酸插入的重组质粒，他应做什么实验来检查插入片段的方向核苷酸插入的重组质粒，他应做什么实验来检查插入片段的方向ScaI XbaI片段片段 Tcr（当有外源（当有外源DNA插入，插入，该基因失活）该基因失活）pBR32
46、2 AprTcr图中字母代表的意义：图中字母代表的意义：N-NotI；Sp-SpeI；SI-SacI；Sf-SflI；H-HindIII；B-BamHI；Xb-XbaI；S-SalI；K-KpnI；E-EcoRIAprH SI B Xb S K EN Sp SI SfGATCC GG CCTAGpA10.一一DNA分子中有一个分子中有一个SmaI识别位点识别位点(CCCGGG),现有一研究现有一研究生想要将这识别位点顺序完全除去生想要将这识别位点顺序完全除去,现已知该位点及两侧的序现已知该位点及两侧的序列为列为ACCCGGGT,他应该如何设计实验他应该如何设计实验?11.一研究者想在下列三种限
47、制酶位点的一研究者想在下列三种限制酶位点的BamHI中插入另外一段中插入另外一段低聚核苷酸低聚核苷酸,该段低聚核苷酸中的限制酶位点如下所示该段低聚核苷酸中的限制酶位点如下所示,要求要求获得的重组获得的重组DNA分子的各种限制酶位点按一种方式排列分子的各种限制酶位点按一种方式排列,他他应如何设计实验分离到所需的应如何设计实验分离到所需的DNA分子分子?EcoRIBamHIHindIIIBamHISmaI SacIEcoRIPstIBamHI+EBPESISmBH12.如何使下列的限制酶识别位点由一种序列变为第二种如何使下列的限制酶识别位点由一种序列变为第二种,或由第一或由第一种变为第三种种变为第
48、三种?GATCGATATCGATCGATC；TCGATCGCGATCGCGCGCGA；Sau3AIEcoRVClaITaqIREIIBssHIAAGCTTAAGCGCTTHindIIIThaI，HaeII13.下图的质粒载体中的四环素抗性基因内有一下图的质粒载体中的四环素抗性基因内有一BamHI位点位点,一研究一研究者想用体外缺失或插入的办法使者想用体外缺失或插入的办法使BamHI位点消除位点消除,并获得如图所并获得如图所示的重组质粒，他应如何设计此实验示的重组质粒，他应如何设计此实验?假定密码子的增减对基因假定密码子的增减对基因的抗性无任何影响。的抗性无任何影响。HindIIIEcoRIEcoRI EcoRIBamHIBamHI位点消除位点消除总长为总长为9kb0.5kbTcr