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1、常用工具酶简介常用工具酶简介 第一节第一节DNADNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase)1 DNA Ligase1.1 概念1.2 分类 根据连接反应时所需能量辅助因子的不同：依赖ATP的DNA ligase 依赖NAD+的DNA ligase 按照来源分：T4噬菌体DNA ligase 大肠杆菌DNA ligase 热稳定DNA ligase2 DNA ligase简介简介2.1 T4 DNA ligase 连接类型：连接类型：DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA的黏性末端和平末端的黏性末端和平末端 2.2 大肠杆菌大肠杆菌 DNA ligas
2、e dsDNA的黏性末端和平末端的黏性末端和平末端 3 DNA ligase 催化连接反应的特点3.1 需要3-OH 和5-P3.2 需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活因子3.3 被连接的是dsDNA3.4 只能封闭缺口4 影响DNA ligase 连接反应的因素4.1 温度 黏性末端 4-15 平末端 10-204.2 连接酶浓度 平末端 1-2个单位 黏性末端 0.1个单位 4.3 ATP浓度4.4 DNA片段末端 第二节 DNA 聚合酶和反转录酶DNA 聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。1 D
3、NA polymerasepolymerase分类分类依赖于DNA的DNA聚合酶:Ecoli DNA polymerase I klenow片段 T4 phage DNA ploymerase T7 phage DNA ploymerase 耐热DNA聚合酶(Taq 酶)依赖于RNA的DNA聚合酶:反转录酶(reverse transcriptase)1.1 Ecoli DNA polymerase I 分类：分类：DNA pol I DNA pol DNA pol DNA pol I特性：5-3DNA聚合酶活性 3-5外切酶活性 5-3外切酶活性 （切口平移）Mn2+存在时存在时 Mg2+存
4、在时存在时 DNase I作用特点作用特点DNaseI HO P5 35 35 3DNaseI与与Pol I 的的切口移位切口移位Pol I1.2 Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶I I的枯草杆菌蛋白酶水解产物。活性：5 3聚合酶 3 5外切酶用途：3-末端补平 3-末端抹平 cDNA第二链合成 双脱氧系统测序3-末端补齐 3-末端标记5-ACGTTGCAAACTG-3 3-TGCAACGTTTGAC.5 cDNA第二链合成 mRNA 3-UGCAACGUUUGAC.5 c DNA 5-ACGTTGCAAACTG GAC5353555555333333热变性热变性随机引物退火 -32Pd
5、NTP Klenow 酶酶 555-5 1.3 T4 DNA polymerase 特点：特点：53聚合酶活性聚合酶活性 35外切酶活性外切酶活性 外切酶活性外切酶活性 聚合酶活性聚合酶活性 无无dNTP dNTP用途：补平反应末端标记抹平反应1.4 Taq DNA polymerase 特点：特点：分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应，最适反应温度温度75-80。5-3聚合酶活性聚合酶活性 5-3外切酶活性外切酶活性 用途：用途：主要用于主要用于DNA的体外扩增的体外扩增 Taq Pol 和和PCR 5 3 变性变性 3 5 5 3 引物引物 3 5 复
6、性复性 5 3 5 3 3 5 引物引物 3 5 5 3 延伸延伸 5 3 3 5 3 5 1.5 反转录酶反转录酶(reverse transcripase)用途：用途：cDNA第一链的合成第一链的合成 补平反应补平反应 用于用于DNA测序测序 第三节 DNA修饰酶1.1 末端转移酶（末端转移酶（TdT）反应特点反应特点 在酶的催化下将在酶的催化下将dNTP加到加到DNA分子的分子的3OH末末端，催化作用不需要模板。端，催化作用不需要模板。用途用途 3-加尾，便于两加尾，便于两DNA分子重组分子重组 3-末端标记末端标记 -32PATP ATP 5 P OH 3 5 32P OH 33HO
7、P 5 3 HO 32P 5 -32PATP ATP 5 P OH 3 5 32P OH 33HO P 5 3 HO 32P 5 1.2 T4 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化反应：催化反应：正向反应正向反应 催化催化5-OH末端的磷酸化末端的磷酸化 交换反应交换反应1.2 T4 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 用途：用途：1)DNA或或RNA的的5末端标记末端标记 2)分子克隆过程中以获得分子克隆过程中以获得5-磷酸基末端，磷酸基末端，便于连接酶反应便于连接酶反应1.3 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 用途用途 1)载体载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率
8、重组频率 2)5端端 核酸末端标记核酸末端标记 I II 5 P OH3 5HO OH3 5 P OH 3 3HO P 5 3HO OH5 3HO P 5 碱性碱性磷酸酶与磷酸酶与T4 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶活性活性 第四节 外切核酸酶1 外切核酸酶概念2 分类 按照酶对底物二级结构的专一性，分为：作用于单链的外切核酸酶 作用于双链的外切核酸酶 第五节单链内切核酸酶1.1 S1核酸酶核酸酶 特点：特点：ss-DNA;ss-RNA;双螺旋变性区双螺旋变性区 用途用途 1)基因突变基因突变-缺失，常与外切酶，如缺失，常与外切酶，如ExoIII、外切酶、外切酶、Bal31连用连用 2)DNA定
9、序分析定序分析 3)S1作图法作图法 4)基因结构分析基因结构分析 5)tRNA结构分析结构分析 ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)555555S1核酸酶活性核酸酶活性 1.2 Bal 31 核酸酶 对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从3OH端降解DNA。对于L-DNA，它表现3-5的外切酶活性和5-3的外切酶活性，可又有控制地从3端和5端逐个水解除去单核苷酸，产生缩短了的DNA分子。1.3 DNase I 用途用途 1)切口移位，制备切口移位，制备DNA探针探针 2)制备制备RNA样品时除去样品时除去DNA分子分子 3)基因突变时产生切口基因突变时产生切口 d
10、s-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断口裂口裂口(gap)缺口缺口(nick)断口断口(cut)3HO P53HO P5 Mn+存在时存在时 Mg+存在时存在时 DNaseI作用特点作用特点DNaseI HO P5 35 35 3DNaseI与与Pol I 的的切口移位切口移位Pol I 第六节 RNA酶1.1 RNase 用途：用途：在在DNA制备时用于降解制备时用于降解RNA分子分子 去除去除DNA:RNA 或或RNA:RNA中没有杂合中没有杂合的的 RNA区域区域1.2 RNase H 特异地降解特异地降解DNA:RNA杂合链中的杂合链中的RNA部分，产生不同长度的具有部分，产生
11、不同长度的具有3OH和和5P端的端的寡核苷酸，它不能降解单链或双链的寡核苷酸，它不能降解单链或双链的DNA（或（或RNA).5AAGCTT3 HindIII 5A AGCTT3 3TTCGAA5 3TTCGA A5 S1 dNTP+klenow frag 5A T3 5AAGCT AGCTT3 3T A5 3TTCGA TCGAA5 T4 DNA连接酶连接酶 T4 DNA连接酶连接酶 5AT3 5AAGCTAGCTT3 3TA5 3TTCGATCGAA5切平反应和补平反应切平反应和补平反应 四种不同补平反应四种不同补平反应5-GGATCC-3 BamHI 5-G GATCC-33-CCTAGG-5 3-CCTAG G-5 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP5-GGATC 5-GG 5-GGA 5-GGAT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 CTAGG-5 GG-5 AGG-5 TAGG-5 I S1 S1 S1 5-GG CC-3 5-GGA TCC-3 5-GGAT ATCC-3 3-CC GG-5 3-CCT AGG-5 3-CCTA TAGG-5 II III 思考题：思考题：常见工具酶的特点常见工具酶的特点