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1、分子生物学第四章基因工程常用工具酶第一页，讲稿共四十五页哦Manipulating Genes-Transferring GenesExtract DNARestrictionLigationTransformationSelectionCulturing2第二页，讲稿共四十五页哦重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶3第三页，讲稿共四十五页哦我我们们的的基基本本目目的的是是：把把外外源源基基因因与与载载体体连连接接在在一一起起形形成成重重组组DNA分分子子，最最少少需需要要以以下下两两类类工工具具酶：酶：1、准确切割、准确切割DNA分子的工具（分子的工具（“分子手术
2、刀分子手术刀”）-限制性内切酶限制性内切酶2、DNA片段的连接工具（片段的连接工具（“分子缝合针分子缝合针”）-DNA连接酶连接酶4第四页，讲稿共四十五页哦 本章内容本章内容 第一节 限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶的发现 二、I类和III类限制和修饰酶的基本特征 三、II类限制和修饰酶的基本特征第二节 DNA连接酶第三节 其它工具酶 一、聚合酶 二、末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)三、SI核酸酶 四、Bal31核酸酶 五、碱性磷酸单脂酶 5第五页，讲稿共四十五页哦第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶上海自来水来自海上黄山落叶松叶落山黄识别序列回文结构6第六页，讲稿共四十五页哦u 20世
3、纪70年代病毒学研究中最有深远影响的发现之一u 在对噬菌体与其寄主相互关系的研究中发现的一、限制性内切酶的发现一、限制性内切酶的发现77第七页，讲稿共四十五页哦限制性内切酶的分类（三大类）限制性内切酶的分类（三大类）I类，II类,III类.I类，III类为限制-修饰酶。兼具限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点专一，适合于DNA重组。8第八页，讲稿共四十五页哦原核细胞中限制和修饰系统原核细胞中限制和修饰系统 I类酶 II类酶 III类酶 酶分子 三亚基双功能 内切酶与甲基化酶分离 二亚基双 能识别位点 二分非对称序列
4、4-6bp序列，回文结构 5-7bp非对称序列切割位点 距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识别位点 在识别位点 下游24-26bp限制性反应 互斥 分开反应 同时竟争与甲基化反应限制作用 需要ATP 需要 需要 不需要 9第九页，讲稿共四十五页哦二、二、I I类酶，类酶，IIIIII类酶限制类酶限制-修饰酶基本特怔修饰酶基本特怔1、I类酶，EcoK，EcoB。（1）异源多聚体，亚基R.M.S分别具有限制,修饰酶的作用，特 异性位点识别活性。（2）I类酶与 DNA识别位点结合依赖亚基 M与辅助因子S腺苷甲硫氨酸(SAM)相互作用。（3）S腺苷甲硫氨酸(SAM)通过变构作用使酶处于活性状态，
5、酶与 DNA识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活性，或限制,或限修饰，或不限制不限修饰 10第十页，讲稿共四十五页哦11第十一页，讲稿共四十五页哦2 2、IIIIII类限制修饰酶基本特怔类限制修饰酶基本特怔（1）亚基R，MS亚基组成。MS亚基具有识别和甲基化修饰双重作用.（2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。（3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关 MboII 识别 5-AAGA-3 切割位点 5-GAAGANNNNNNNN/N-3 3-CTTCTNNNNNNN/NN-512第十二页，讲稿共四十五页哦1 1、命名原则、命名原则:Hind属属Haemophilus influen
6、zaed菌菌株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d菌菌株的第株的第3种酶种酶 第一个字母是细菌属名的第一个字母，要大写；第2、3个字母是细菌种名的前两个字母，要小写；上述字母都是用斜体。接着是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书写；如果同一菌株有不同的内切酶时，按发现次序分别 用罗马数字、表示。种种菌株菌株序序三、三、II类限制修饰酶基本特怔类限制修饰酶基本特怔13第十三页，讲稿共四十五页哦识别序列特点识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)(palindrome)即反向重复结构，以即反向重复结构，以DNADNA分子中某一处为轴，其两侧分子中某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。核
7、苷酸排列呈回文对称的序列。每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切割的特每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切割的特异序列，称为限制性位点或切点（异序列，称为限制性位点或切点（48bp48bp）。）。2 2、识别序列：、识别序列：GGA TCCCCT AGGBamH14第十四页，讲稿共四十五页哦3 3、切割方式、切割方式A以酶切特点来分 同位酶：识别相同序列，切点不同。同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。B以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补 DNA是分子重组的基础15第
8、十五页，讲稿共四十五页哦同裂酶同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3或5粘性末端，称为同识异切。16第十六页，讲稿共四十五页哦同裂酶同裂酶同识同识同同切切17第十七页，讲稿共四十五页哦同裂酶同裂酶同识同识异异切切18第十八页，讲稿共四十五页哦同同 尾尾 酶酶 同尾酶同尾酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。19第十九页，讲稿共四十五页哦可变酶可变酶可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。如，Bstp
9、，其识别顺序为GGTNACC。20第二十页，讲稿共四十五页哦Bam HCCCGGGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGSam ICCCGGGGGGCCCGGGCCC+平末端（平末端（Bluntend）：）：对称轴切割对称轴切割对称轴切割对称轴切割粘性末端（粘性末端（Stickyend）：）：交错切割交错切割切口：切口：平端切口、粘端切口平端切口、粘端切口21第二十一页，讲稿共四十五页哦几几个个常常用用限限制制性性内内切切酶酶及及其其切切点点22第二十二页，讲稿共四十五页哦DNA分子的两条脱氧核苷酸长链是反向平行的，一条链是53方向，另一条是35方向。在一般表示DNA分子碱基序列
10、的图中，上边一条链是53方向，下边一条是35方向。限制性内切酶的识别序列也是有方向性的，通常写出的限制酶的识别序列是专指53那条链上的碱基序列。23第二十三页，讲稿共四十五页哦 如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。24第二十四页，讲稿共四十五页哦限制性内切酶的剪切方式限制性内切酶的剪切方式25第二十五页，讲稿共四十五页哦 Yu Zheng,et al.Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes.Nucleic
11、Acids Res.,2009,37:e1.Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence.The preparation of the shotgun sequence clones is,in fact,a biological experiment.It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli an
12、d which cannot.By analyzing the complete set of sequences from such an experiment,it is possible to identify genes lethal to E.coli.26第二十六页，讲稿共四十五页哦 Among this set are genes encoding restriction enzymes which,when active in E.coli,lead to cell death by cleaving the E.coli genome at the restriction e
13、nzyme recognition sites.By analyzing shotgun sequence data sets we show that this is a reliable method to detect active restriction enzyme genes in newly sequenced genomes,thereby facilitating functional annotation.Active restriction enzyme genes have been identified,and their activity demonstrated
14、biochemically,in the sequenced genomes of Methanocaldococcus jannaschii,Bacillus cereus ATCC 10987 and Methylococcus capsulatus.27第二十七页，讲稿共四十五页哦四、酶切反应体系四、酶切反应体系DNA或RNA.测浓度缓冲液（Mg2+)10双蒸水酶（含甘油）28第二十八页，讲稿共四十五页哦部分消化和完全消化部分消化和完全消化构建载体时，若目的基因内部存在与多克隆位点相同构建载体时，若目的基因内部存在与多克隆位点相同酶切位点时，可以考虑使用部分酶切酶切位点时，可以考虑使用部
15、分酶切29第二十九页，讲稿共四十五页哦 常用限制性核酸内切酶的特性常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称微生物名称酶名称酶名称识别顺序识别顺序同裂酶同裂酶同尾酶同尾酶Bacillus amyloliquefaciens H解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌BamHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil球芽孢杆菌球芽孢杆菌Bgl ACATCTEscherichia coli RY13大肠杆菌大肠杆菌EcoRGAATTCHaemophilus influenzae流感嗜血菌流感嗜血菌Hind AAGCTTHsuProvidencia stuartii 164普罗威登细菌普罗威
16、登细菌PstCTGCAGSalpStreptomyces albusSubspecies pathocidicus白色链球菌白色链球菌SalGTCGACAvaXho30第三十页，讲稿共四十五页哦(1)限制性内切酶能够识别和切割单链DNA，例如有些酶能够识别和切割非回文序列，但这种酶在基因工程应用不够广泛限制性内切酶能否切割单链？限制性内切酶能否切割单链？(2)基因工程中的限制性内切酶主要主要是识别和切割双链DNA，因为大多数限制内切酶是以二聚体二聚体的形式与DNA结合，酶与DNA形成稳定的化合物，产生反应，也有部分酶是以单体单体的形式与DNA结合31第三十一页，讲稿共四十五页哦第二节第二节 D
17、NADNA连接酶连接酶-“-“分子缝合针分子缝合针”DNA连接酶（DNA Ligase）：催化两条DNA链的3-OH和5-P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。例如:T4 DNA连接酶。32第三十二页，讲稿共四十五页哦外源基因与载体的连接方式：外源基因与载体的连接方式：（1 1）粘性末端连接）粘性末端连接方式：同一限制性内切酶切点的连接 不同限制性内切酶切点的连接33第三十三页，讲稿共四十五页哦（2 2）平端连接）平端连接适用于：限制性内切酶作用产生的平端 粘端经特殊酶处理变为平端34第三十四页，讲稿共四十五页哦（3 3）同聚物加尾连接）同聚物加尾连接 由末端转移酶（Termina
18、l transferase）作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。35第三十五页，讲稿共四十五页哦（4 4）人工接头）人工接头 平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。36第三十六页，讲稿共四十五页哦第三节第三节 其它工具酶其它工具酶修补工具酶 DNA聚合酶I 可被枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解为2个片段，其中带有C末端的大片段叫DNA聚合酶I 大片段（Klenow片段）。它具有53聚合酶活性或3-5外切酶活性。而N端小片段只具有5-3 外切酶活性。37第三十七页，讲稿共四十五页哦KlenowKlenow大片段大片段-补平补平或标记标记限制酶
19、切割产生的3凹端，例 5-TTCGGACTACG-3 3-AAGCCTGATGCCAT-5 T4 噬菌体DNA 聚合酶具有5-3聚合酶活性或3-5外切酶活性。其3-5外切酶活性比Klenow片段强200倍。38第三十八页，讲稿共四十五页哦末端加工酶S1核酸酶，碱性磷酸单脂酶末端转移酶 催化DNA链的3-OH端加脱氧核糖核苷酸(dNTP)的聚合反应，使载体和待克隆基因接上互补的同聚体尾部（人工加polyA 或polyT 尾）反转录酶(用原核系统表达具内含子的真核基因)去磷酸化酶：载体去磷酸化防治自身环化39第三十九页，讲稿共四十五页哦核酸酶S1 用途：1.除去双链DNA的粘性末端以产生 平末端；
20、2.除去cDNA合成时形成的发夹结构；3.分析RNA的茎环结构以及DNA-RNA分子的杂交情况等。40第四十页，讲稿共四十五页哦 功能：催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3-OH末端上。1.底物是单链DNA或有3突出末端的 双链 DNA。OH53Mg2+dNTP53(A、G、C、T)nnppi 53OHMg2+dNTPnppi53(A、G、C、T)n41第四十一页，讲稿共四十五页哦 2.底物是平端或3 凹端的双链DNA。53Co2+dNTP53(A、G、C、T)nnppi53Co2+dNTPnppi53OHOH(A、G、C、T)n42第四十二页，讲稿共四十五页哦 用途：1.主要作用是在载体或目的基因 3末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。2.DNA 3末端的同位素标记。43第四十三页，讲稿共四十五页哦实验中经常遇到的问题酶切不开酶切不开连接失败连接失败44第四十四页，讲稿共四十五页哦酶切不开的原因酶切不开的原因DNA纯化不理想，存在酶的抑制剂反应体系不合理，缓冲液使用错误用酶量偏大，甘油浓度太高酶失活温度不合理45第四十五页，讲稿共四十五页哦