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1、分子克隆常用工具酶植物基因工程 每一单链具有每一单链具有 5 5-3-3极性极性 两条单链间以氢键连接两条单链间以氢键连接 两条单链，极性相反，反向平行两条单链，极性相反，反向平行 以中心为轴，向右盘旋以中心为轴，向右盘旋Structure and featuresDNA 的基本结构的基本结构植物基因工程植物基因工程Replication植物基因工程分子克隆操作过程： 克隆目的基因将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成重组DNA导入宿主细胞筛选、鉴定扩增和表达。植物基因工程 工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。 要把不同基因的DNA
2、线形分子片段准确地切出来，需 要 各 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶 （ r e s t r i c t i o n endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要 DNA 聚合酶（polymerase）等。 因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。植物基因工程植物基因工程 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNADNA连接酶连接酶 DNADNA聚合酶聚合酶 核酸酶核酸酶 核酸修饰酶核酸修饰酶用于核酸操作的常用工具酶用于核酸操作的常用工具酶工具酶名称工具酶名称 主要功能限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 Restri
3、ction endonucleases在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割DNA连接酶连接酶DNA ligase将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成一个整体DNA聚合酶聚合酶IDNA polymerase I通过向 3 端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂口，即53 DNA 聚合酶活性与 35及53-外切酶活性多核苷酸激酶多核苷酸激酶DNA polymerase kinease催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5-OH末端上反转录酶反转录酶Reverse transcriptase以RNA分子为模板合成互补的cDNA链DNA末端转移酶末端转移酶DNA
4、terminal transferase将同聚物尾巴加到线性双链 或单链DNA分子的3-OH末端或DNA的3-末端标记dNTP降解酶降解酶 S1nuclease S1降解单链DNA或RNA，产生带5磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA polymerase能在高温（72）下的单链DNA为模板，从53方向合成新生的互补链常用的工具酶性质及功能植物基因工程植物基因工程第一节第一节 分子克隆最常用两个工具酶分子克隆最常用两个工具酶 植物基因工程限制性内切酶限制性内切酶 Restriction enzymes 植物基因工程 限制性内切酶是
5、一种能识别 DNA 上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一种内切核酸酶。植物基因工程植物基因工程二、二、 限制性核酸内切酶的命名原则限制性核酸内切酶的命名原则 植物基因工程 一般分子量为一般分子量为60kd60kd，单链多肽，最适，单链多肽，最适 pH pH 为为 6 68 8 NaClNaCl有抑制作用，能被有抑制作用，能被Mg2+Mg2+激活，巯基有保护作用激活，巯基有保护作用 对热不稳定，通常贮存于对热不稳定，通常贮存于2020环境。为避免反复环境。为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有冻溶使酶失活，商品酶均含有5050甘油，使用时添加甘油，使用时添加相应的
6、缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。三、限制性核酸内切酶学特性三、限制性核酸内切酶学特性植物基因工程 它对底物要求有特异它对底物要求有特异的序列，通常的识别序列的序列，通常的识别序列是是4 bp 6bp，有些则，有些则为为7bp8bp，甚或多于，甚或多于8bp。 多数限制酶的识别序多数限制酶的识别序列为回文结构，在识别序列为回文结构，在识别序列内或其附近水解列内或其附近水解DNA链链中的磷酸二酯键。中的磷酸二酯键。植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程 温度：一般温度：一般3737 盐离子浓度：盐离子浓度：
7、NaNa，Mg2Mg2 缓冲体系缓冲体系：具有稳定：具有稳定 pH pH 环境环境的的Tris-HClTris-HCl缓冲缓冲体系体系 DTTDTT用于保持用于保持酶酶 稳定性稳定性和活性和活性 反应体积和甘油浓度：反应体积和甘油浓度： 商品化商品化的限制性内切核酸酶均加的限制性内切核酸酶均加5050甘油作为保护剂，一般在甘油作为保护剂，一般在-20-20保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的1010，否则甘油浓度，否则甘油浓度过高，影响酶切反应过高，影响酶切反应 反应时间：反应时间：通常为通常为1 1h h；进行大量进行大量DNADNA酶
8、切反应时一般让酶解过夜酶切反应时一般让酶解过夜 DNADNA纯度和结构纯度和结构 DNADNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、样品中所含的蛋白质、有机溶剂、 RNARNA等杂质会影等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNADNA，DNADNA的甲基化位的甲基化位置会影响酶切反应。置会影响酶切反应。植物基因工程II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系型限制性核酸内切酶酶解反应体系植物基因工程Star activity “星星”活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端低离子强度、极端ppH值等，会使
9、一些核酸内切值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。 在 名 称 右 上 角 加 一 个 星 号在 名 称 右 上 角 加 一 个 星 号 (*)表 示表 示 , 如如EcoR*：AATT ；EcoR：GAATTC 必须采用规范的实验步骤必须采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条应用推荐的反应条件。件。植物基因工程植物基因工程位点偏爱（位点偏爱（site preference） 某些限制性内切酶对不同位置的某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割同一个识别序列表现出不同的切割效率。效率。植物基因工程第二节第二节
10、 DNA连接酶连接酶 DNA Ligase植物基因工程一、一、DNA连接酶性质连接酶性质 植物基因工程植物基因工程T4 DNA ligaseE.coli DNA ligase来源来源T4 噬菌体噬菌体大肠杆菌大肠杆菌分子量分子量6000075000辅助因子辅助因子ATPNAD+底物底物双链双链DNA分子的粘、平端分子的粘、平端RNA-DNA杂合体，杂合体，RNA链链缺口、双链缺口、双链DNA分子中的分子中的单链缺口单链缺口同源互补粘端同源互补粘端双链分子中的单链缺口双链分子中的单链缺口应用范围应用范围广泛、效率高广泛、效率高 窄窄两种DNA连接酶比较 二、常用连接酶二、常用连接酶植物基因工程植
11、物基因工程三、三、DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件植物基因工程植物基因工程植物基因工程a.a. 直接用直接用T4 DNAT4 DNA连接酶连接连接酶连接：效率不高，较少采用。：效率不高，较少采用。b.b. 同聚物加尾同聚物加尾连接平末端连接平末端DNADNA片段：先用末端核苷酸转片段：先用末端核苷酸转移酶，给平末端移酶，给平末端DNADNA分子加上同聚物尾巴后再用分子加上同聚物尾巴后再用DNADNA连接酶进行连接连接酶进行连接c.c. 用衔接物连接用衔接物连接平末端平末端DNADNA分子：目的是在平末端分子分子：目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生上构建限制性核
12、酸内切酶酶切位点，经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNADNA连接连接植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程四、重组四、重组DNA实验的一般程序实验的一般程序a.a. 选用一种对载体选用一种对载体DNADNA只具唯一限制识别位点的限制酶只具唯一限制识别位点的限制酶（如（如EcoREcoR I I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性作位点特异的切割，形成全长的具粘性末端的线性末端的线性DNADNA分子分子b.b. 再将外源再将外源DNADNA片段也用同一种酶作相同的消化。片段也用同一种酶作相同的消化
13、。c.c. 混合，加入混合，加入DNADNA连接酶。由于具有相同的（如连接酶。由于具有相同的（如EcoREcoR I I）粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经DNADNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNADNA分子。分子。植物基因工程第二节第二节 其他分子克隆工具酶其他分子克隆工具酶1.1. 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I2.2. K1enowK1enow片段片段3.3. T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶4.4. TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶5.5. 逆转录酶逆转录酶：依
14、赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶6.6. RNARNA聚合酶聚合酶植物基因工程植物基因工程植物基因工程基本用途基本用途大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment) 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I经枯草杆菌蛋白酶处理经枯草杆菌蛋白酶处理, ,获得获得N N端三分之二的大肽段端三分之二的大肽段, ,即即Klenow Klenow 酶。酶。 Klenow Klenow 酶仍拥有酶仍拥有5353的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性和和3535的核酸外切酶活性，但失去了的核酸外切酶活性，但失去了5 35 3的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。 植物基因
15、工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程 有有35的核酸外切酶活性和的核酸外切酶活性和 53的的DNA聚合酶活性。聚合酶活性。 在无在无dNTP时，可以从任何时，可以从任何 3-OH端外切端外切 T4 DNA T4 DNA 聚合酶聚合酶 (T4 phage DNA polymerase)植物基因工程 基本用途基本用途植物基因工程植物基因工程植物基因工程 反转录酶反转录酶(REVERSE TRANSCRIPTASE) 主要用途：转录主要用途：转录 mRNA mRNA 成为成为 cDNAcDNA 制备基因片段制备基因片段植物基因工程双向外切双向外切DNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNA链链植物基
16、因工程植物基因工程 功能：功能： 降解降解 ssDNA 或或 ssRNA 形成形成 5-磷酸末端的磷酸末端的单或寡核苷酸片段。单或寡核苷酸片段。植物基因工程植物基因工程应用：应用：1)1) 分析分析DNADNA：RNARNA杂交体结构（杂交体结构（S1 mappingS1 mapping）。确定内）。确定内含子部位。含子部位。2)2) 切除切除DNADNA片段上的单链末端，形成平末端片段上的单链末端，形成平末端. . 3)3) 切开切开 cDNAcDNA 合成过程中形成的发夹环合成过程中形成的发夹环4)4) 在限制酶位点上产生小缺失在限制酶位点上产生小缺失植物基因工程植物基因工程RNase-F
17、ree DNase 是一种DNase I（核酸内切酶）， 可以降解双链或单链 DNA。RNase H： 特异性地水解杂交到 DNA 链上的 RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。 RNase A：广泛应用的核酸内切酶。对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。Rnase 酶非常稳定，常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。 DEPC 处理。 功能：功能：催化去除催化去除 DNA、RNA 上的上的 5 端磷酸端磷酸基团基团, 从从DNA片段上除去片段上除去5磷酸以防自身连磷酸以防自身连接。接。 用途：用途：在在DNA
18、连接之前常用它处理克隆载体连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接。以防止载体自身连接。植物基因工程植物基因工程Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)T4-多核苷酸磷酸激酶多核苷酸磷酸激酶植物基因工程植物基因工程功能：功能：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，沿着沿着55到到 3 3加到加到 DNA DNA 链的链的 3 3- -OH OH 末端。末端。该过程不该过程不需要需要DNADNA模板模板，对双链、单链，对双链、单链 DNA DNA 都适用。经常用于人都适用。经常用于人工粘性末端的构建。
19、工粘性末端的构建。 植物基因工程原核生物原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所不被相应的限制酶所切割。切割。 Dam 甲基化酶可在甲基化酶可在 GAmTC 序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤 N6 位位置上引入甲基置上引入甲基。受。受其影响的酶有其影响的酶有Bccll II、MbbooII等。等。 Dcm 甲基化酶识别甲基化酶识别 CCmAGG 或或 CCmTGG 序列，序列，在第二个胞嘧啶在第二个胞嘧啶 C 的的 C5 位置上引入甲基位置上引入甲基。受其影响的酶有EccooR IIII等植物基因工程植
20、物基因工程植物基因工程思考题：思考题：u 载体构建的工具酶主要有那些类型？u 限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制与修饰。核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响其酶活性的因素。u T4 DNA连接酶的性质及用途.u Klenow 酶的基本性质及用途。u 其他工具酶的用途。练练 习习 题题1. 一种一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb HindIII 3kb 、7kb EcoRI/PstI 2、3、5kb PstI 10kb HindIII/PstI 1
21、、3、6kb 将各限制酶位点绘制在将各限制酶位点绘制在DNA分子上。分子上。 2. 另一另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。分子上。 EcoRI 1、3、6kb EcoRI/HindIII 1、3kb HindIII 4、6kb EcoRI/PstI 1、3、5kb PstI 2、8kb HindIII/PstI 2、6kb 3.下图中的一段下图中的一段DNA分子上有两个限制酶分子上有两个限制酶PstI和和EcoRI识别位点，识别位点，两位点相距两位点相距10bp，现有一研究生要分析，现有一研究生要分析EcoRI右
22、侧右侧500bp区域内区域内的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定区，他应如何设计此实验？假定EcoRIPstI间的间的10bp除去后并除去后并不影响任何结果分析，但不影响任何结果分析，但PstI位点左侧的位点左侧的DNA不能除去不能除去 10bp 500bp PstI EcoRI 4. 假如假如PstI位点为另一限制酶位点为另一限制酶HindIII，实验又该如何设计？，实验又该如何设计？ 5. 现有一研究者打算将一现有一研究者打算将一EcoRI DNA片段克隆到一个片段克隆到一个DNA分子分
23、子的的 BamHI 位点以便位点以便 DNA 扩增，但扩增后的扩增，但扩增后的 DNA 分子又可用分子又可用BamHI 限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。 6. 一研究生要将一质粒（一研究生要将一质粒（pI）上的）上的BamHI-HindIII片段取代另一片段取代另一质粒（质粒（pII）上的）上的BamHI-XbaI片段，所获重组质粒（片段，所获重组质粒（pIII）上）上的插入片段要求能用的插入片段要求能用BamHI-HindIII进行回收，问如何设计此进行回收，问如何设计此实验？实验？10bp 500bp HindIII EcoRI H Xb H
24、5kb pI 1kb 6kb pII .5kb 6kb pIII 1kb B B B 7. 现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示：现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示： 已知已知HinHindIIIdIII克隆片段中的克隆片段中的BamBamHIHI（3kb3kb）片段含有一完整的基）片段含有一完整的基因编码区，现要将此因编码区，现要将此3kb3kb的的BamBamHIHI片段克隆到另一表达载体片段克隆到另一表达载体pBpB的的BamBamHIHI位点，如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相位点，如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相同的阅读框架？如
25、何证明插入基因的转录方向是相同的？同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是相同的？ HindIII PstIBamHI PstI BamHIBamHI HindIIIpA 8kb pB0.5 2.58. 为了检测绿豆核酸酶对为了检测绿豆核酸酶对5-端突起的单链端突起的单链DNA切割是否准确有效，切割是否准确有效，即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常精巧的实验，其中一个实验是将一精巧的实验，其中一个实验是将一XbaI片段插入片段插入pBR322的的Apr基因内的基因内的ScaI位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿
26、豆位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿豆核酸酶的作用确实与预期的结果一致，你能否设计出这一套实验？核酸酶的作用确实与预期的结果一致，你能否设计出这一套实验？(pBR322除含有除含有Apr基因外，还含有基因外，还含有Tcr基因基因)。9. 某研究者计划将具有限制酶某研究者计划将具有限制酶BamHI粘性末端结构的一段低聚核粘性末端结构的一段低聚核苷酸分子插入到一载体的克隆位点区。现假设他已获得具有低苷酸分子插入到一载体的克隆位点区。现假设他已获得具有低聚核苷酸插入的重组质粒，他应做什么实验来检查插入片段的聚核苷酸插入的重组质粒，他应做什么实验来检查插入片段的方向方向 ScaI XbaI片段
27、片段 Tcr（当有外源（当有外源DNA插入，插入， 该基因失活）该基因失活） pBR322 AprTcr图中字母代表的意义：图中字母代表的意义：N-NotI；Sp-SpeI；SI-SacI；Sf-SflI；H-HindIII；B-BamHI； Xb-XbaI；S-SalI；K-KpnI；E-EcoRIAprH SI B Xb S K EN Sp SI SfGATCC GG CCTAGpA 10. 一一DNA分子中有一个分子中有一个SmaI识别位点识别位点(CCCGGG), 现有一研究现有一研究生想要将这识别位点顺序完全除去生想要将这识别位点顺序完全除去,现已知该位点及两侧的序现已知该位点及两侧的序列为列为ACCCGGGT,他应该如何设计实验他应该如何设计实验? 11. 一研究者想在下列三种限制酶位点的一研究者想在下列三种限制酶位点的BamHI中插入另外一段中插入另外一段低聚核苷酸低聚核苷酸,该段低聚核苷酸中的限制酶位点如下所示该段低聚核苷酸中的限制酶位点如下所示, 要求要求获得的重组获得的重组DNA分子的各种限制酶位点按一种方式排列分子的各种限制酶位点按一种方式排列, 他他应如何设计实验分离到所需的应如何设计实验分离到所需的DNA分子分子?