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1、上海交通大学医学院教案上海交通大学医学院教案教教案案课程名称医学实验技术授课题目高效液相色谱法授课日期年月日授课班级授课时数授课方式理论课授课重点、难点重点：1、色谱法的分类，色谱流出曲线及有关术语；2、色谱法的基本理论；3、分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间之间关系；4、气相色谱流程及气相色谱仪的结构；5、气相色谱固定相的特性；6、检测器性能指标的描述方法；7、液相色谱仪的基本结构及基本概念；难点：1、色谱流出曲线。2、分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间之间关系。授课内容、教具与时间分配第一节 概述（20min）一、高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以
2、液体做流动相的新色谱技术。高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。二、液相色谱分离原理及分类液相色谱分离系统也由两相固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。三、液相色谱与气相色谱的比较液相色谱
3、与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：（1）应用范围不同据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 80%。（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。液相色谱固定相类型多。液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。（3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率
4、慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。第二节 高效液相色谱仪（10min）高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 组成。高压输液系统1.溶剂贮存器2.高压输液泵3.梯度洗脱装置二、进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱
5、柱上进行分离。三、分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。四、检测器检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。第三节 高效液相色谱的固定相和流动相(15min)一、固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.01081.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。
6、二、流动相对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂与检测器匹配。（3）高纯度（4）化学稳定性好（5）低粘度（粘度适中）第四节液固色谱法(10min)一、液固色谱法固定相液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。二、液-固吸附色谱流动相液相色谱的流动相必须符合下列要求：（1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。（2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。（3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。（4）应与所用检测器相匹配。（5）容
7、易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。第五节液液色谱法(15min)液液色谱又称液液分配色谱。在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。一、固定相液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：（1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为30 40m的实心玻璃球和厚度约为1 2 m的多孔性外层所组成。（2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径30 50 m的多孔型颗粒。（3）全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒堆积而成，又
8、称堆积硅珠。二、流动相在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往处于两 个极端，例如当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。第六节化学键合相色谱(25min)一、化学键合固定相法化学键合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。键合相可分为四种键型：（1）硅酸酯型（=Si-O-C=）键合相（2）硅氮型（=Si-N=）键合相（3）硅碳型（=Si-C=）键合相（4）硅氧
9、烷型（=Si-O-Si-C=）键合相二、反相键合相色谱法在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称O D S或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。三、正相键合色谱法四、离子性键合相色谱法化学键合色谱具有下列优点：（1）适用于分离几乎所有类型的化合物。（2）由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。（3）键合固定相对不太强的酸
10、及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。（4）固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。第七节离子交换色谱法(15min)离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。一、固定相离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。二、流动相离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度。第八节排阻色谱法(5min)排阻色谱法也称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法，
11、是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。第九节色谱分离方法的选择(20min)要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。一、相对分子质量对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在200 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则可用空间排阻色谱法。二、溶解度水溶性样品最好
12、用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液-固色谱法。授课内容、教具与时间分配三、化学结构若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。讲课内容采用 ppt 形式。小结复习思考题参考书一、小结：掌握色谱法的分类，色谱流出曲线及有关术语；掌握色谱法的基本理论，了解柱效的影响因素；掌握分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间之间关系；了解定性、定量分析方法；掌握气相色谱流程及气相色谱仪的结构；掌握气相色谱固定相的特性；掌握检测器性能指标的描述方法；掌握液相色谱仪的基本结构及基本概念；了解液相色谱法的主要类型及固定相、流动相的选择。了解色谱方法选择。二、复习思考题：名词解释：梯度洗脱问答题：1、简述液相色谱分离原理。2、液相色谱与气相色谱的差别主要表现在哪几方面？3、对检测器有哪些要求？4、简述气相色谱固定相的特性。上课教师_第_5_页