植物细胞工程实验室基本技术.pptx

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1、实验室设置基本技术培养基及其配制细胞培养环境控制外植体接种培养 主要内容第1页/共61页1.1 实 验 室 设 置实验室组成基本设备配置培养容器与用具第2页/共61页细胞工程实验室的基本要求实验准备 包括培养基配制，洗涤与灭菌等无菌操作控制培养Culture roomPreparation roomSterili-zing roomSterile operationCytology roomTransi-tion area实验室布局示意图第3页/共61页基 本 实 验 室准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养

2、。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。第4页/共61页辅 助 实 验 室细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。第5页/共61页基本设备配置基本设备灭菌设备光照培养

3、室与设备无菌操作设备细胞学鉴定设备第6页/共61页第7页/共61页第8页/共61页第9页/共61页第10页/共61页第11页/共61页培养容器与用具第12页/共61页第13页/共61页第14页/共61页第15页/共61页1.2 基本技术洗涤技术灭菌技术第16页/共61页洗 涤 剂合成洗涤剂铬酸洗涤液 第17页/共61页 常用的铬酸洗涤液配方 成 分 强酸溶液 中酸溶液 弱酸溶液 重铬酸钾(g)63 120 100 硫 酸(ml)1000 200 100 蒸 馏 水(ml)200 200 1000 注意事项 在蒸馏水中缓慢加入浓硫酸，加热的同时分次加入磨碎的重铬酸钾至其完全融解。重铬酸钾加蒸馏水

4、后加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸。第18页/共61页 玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿、已使用过的试管、烧杯、三角瓶、吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品。塑料用品洗涤 一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。第19页/共61页培养基湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌。玻璃器皿湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热至15040min，或1202h。金属器皿干热灭菌。接种室接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲 醛加高锰酸钾，一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾。第20页/共61页 培养基体积

5、与灭菌时间的关系培养基体积（ml）灭菌温度（）灭菌时间（min.）2050 121 20 50500 121 25 5005000 125 35 第21页/共61页1.3 培养基及其配制 植物细胞培养基及其配制植物细胞培养基及其配制动物细胞培养基及其配制动物细胞培养基及其配制 第22页/共61页植物细胞培养基及配制 培养基基本成分 培养基配方培养基配制第23页/共61页无 机 盐 类大量元素 培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括C、H、O、N、P,K、Ca、Mg、S。微量元素 微量元素的用量一般低于10-510-7克分子浓度。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、M

6、o、Mn、Co。第24页/共61页有 机 成 分糖 维生素 肌醇 氨基酸 其它 第25页/共61页植 物 激 素生长素 细胞分裂素其它第26页/共61页其它附加成分琼脂 活性炭 附加复合成分 第27页/共61页常用培养基配方常用培养基配方：MS（Murashing and Skoog,1962）White（White,1934）B5(Gambor et al,1968)N6(朱至青，1974)第28页/共61页培 养 基 配 制 大量元素配制成10-20 的母液 微量元素配制成100-200 的母液 激素单独配制成mg/ml的母液 培养用培养基按需要按比例加入第29页/共61页动物细胞培养基及

7、配制动物细胞培养基及配制动物细胞培养的营养需求特点动物细胞培养的营养需求特点培养基配方及培养基选择培养基配方及培养基选择培养基配制培养基配制第30页/共61页动物细胞培养液的成分及性质动物细胞培养液的成分及性质氨基酸类氨基酸类（1 1）必需氨基酸）必需氨基酸IleIle、LeuLeu、LysLys、MetMet、PhePhe、ThrThr、CysCys、SerSer等等（2 2）非必需氨基酸）非必需氨基酸维生素类维生素类盐类盐类葡萄糖葡萄糖缓冲系统缓冲系统大多数平衡液采用磷酸盐缓冲系统。大多数平衡液采用磷酸盐缓冲系统。HEPEsHEPEs现被广泛使用，常用浓度为现被广泛使用，常用浓度为25mm

8、ol/L25mmol/L。第31页/共61页矿物类矿物类有机补充物如核苷类、有机补充物如核苷类、TCATCA中间产物、丙酮中间产物、丙酮酸盐、类脂化合物等。酸盐、类脂化合物等。激素类如激素类如insulininsulin、生长激素、氢化可的、生长激素、氢化可的松等。松等。生长因子类如血小板衍生出来的生长因子生长因子类如血小板衍生出来的生长因子（PDGFPDGF）、成纤维细胞生长因子（）、成纤维细胞生长因子（FGFFGF）、）、表皮生长因子（表皮生长因子（EGFEGF）、内皮生长因子及增殖）、内皮生长因子及增殖刺激活性因子（刺激活性因子（MsAMsA）等。）等。第32页/共61页培养基配方及培养

9、基选择培养基配方及培养基选择平衡液溶液（平衡液溶液（BSSBSS）天然培养液天然培养液合成培养液合成培养液无血清培养基无血清培养基其他常用液其他常用液第33页/共61页RingerPBSTyrodeEarleHanksDulbeccoD-hanksNaCl9.008.008.006.808.008.008.00KCl0.420.200.200.400.400.200.40CaCl20.250.200.200.140.10MgCl2.6H2O0.100.10MgSO4.7H2O0.200.20Na2HPO4.H2O1.560.060.06NaH2PO4.2H2O0.050.141.42KH2PO

10、40.200.060.200.06NaHCO31.002.200.350.35葡萄糖葡萄糖1.001.001.00酚红酚红0.020.020.02表1几种常用的BSS（g/L）第34页/共61页天然培养液天然培养液血浆血浆血清血清胚胎浸出液胚胎浸出液鼠尾胶原鼠尾胶原第35页/共61页合成培养液合成培养液人工方法模拟合成人工方法模拟合成如如TC199TC199、MEMMEM、RPM-1640RPM-1640、DMEMDMEM、HamHams F12s F12等。等。主要成分是氨基酸、主要成分是氨基酸、vitaminvitamin、碳水化合物、碳水化合物、无机盐和其他一些辅助物质等。无机盐和其他一

11、些辅助物质等。第36页/共61页无血清培养基无血清培养基包括基础培养基和附加成分。包括基础培养基和附加成分。基础培养基：一般用人工合成的培养液，常用基础培养基：一般用人工合成的培养液，常用Ham F12Ham F12和和DMEMDMEM，1 1：1 1混合，加含混合，加含15mmol/L 15mmol/L HEPEsHEPEs的的1.2g/L NaHCO1.2g/L NaHCO3 3作基础培养液。作基础培养液。第37页/共61页附加成分：附加成分：v培养基质培养基质（纤维连结素、多聚物、胶原等。）（纤维连结素、多聚物、胶原等。）v营养成分营养成分（转铁蛋白、硒酸钠、胰岛素、生长因子等）（转铁蛋

12、白、硒酸钠、胰岛素、生长因子等）v酶抑制剂酶抑制剂（0.1%0.1%0.5%0.5%大豆胰酶抑制剂）大豆胰酶抑制剂）第38页/共61页其他常用液其他常用液消化液消化液1.1.胰蛋白酶液胰蛋白酶液适适 用用 于于 消消 化化 细细 胞胞 间间 质质 较较 少少 的的 组组 织织，常常 用用 浓浓 度度0.25%0.25%、0.125%0.125%，T T：37370 0C C或室温，或室温，pH7.4pH7.4左右。左右。2.Na2.Na2 2EDTAEDTA溶液溶液 3.3.胶原蛋白酶液胶原蛋白酶液第39页/共61页pHpH调整液调整液1.NaHCO1.NaHCO3 3液液2.10%HAc2.

13、10%HAc液液3.HEPEs3.HEPEs液液一一种种H H缓缓冲冲剂剂，可可长长时时间间保保持持较较强强的缓冲作用，维持恒定的的缓冲作用，维持恒定的pHpH值。值。200mmol/LGln200mmol/LGln抗菌液抗菌液青霉素、链霉素（双抗）液青霉素、链霉素（双抗）液 卡那霉素液、制霉菌素液卡那霉素液、制霉菌素液肝素抗凝剂肝素抗凝剂第40页/共61页培养基配制培养基配制BSS配制方法以Hanks液为例：1.按配方表准确称量试剂；2.将CaCl2先溶解在100ml 水中；3.其它成分依次溶解在750ml水中；4.用数滴5.6%NaHCO3溶解酚红；5.将2缓慢倒入3中，搅动；6.将4加入

14、5中；7.将6移入容量瓶中，补足水混匀；8.分装盐水瓶中，高压灭菌，40C冰箱保存。第41页/共61页1.血浆：选用生长1年左右的健康雄鸡，从鸡翼血管处抽取血液，在有肝素时离心（3000rpm,10min）。取上清分装入若干小瓶，低温冰箱保存。2.血清：从出生1周内的小牛动脉采血，每头小牛放血15002000ml。取血瓶内预先放置30ml生理盐水，以便于血凝块和瓶壁的分离。采血后，血瓶倾斜放置2-4h（室温），待血液充分凝结后移入40C冰箱过夜，让血清析出。次日吸取上清，以4000rpm离心30min，收集血清。血清用蔡氏滤器过滤除菌，分装，细菌培养检查无菌后于低温冰箱保存。天然培养基配制方法

15、3.胚胎浸出液：将911d胚龄的鸡胚磨碎和，加等量缓冲液，离心收集上清，即为鸡胚浸出液，于200C700C保存。第42页/共61页1.4 细胞培养环境控制 植物细胞培养环境控制动物细胞培养环境控制第43页/共61页植物细胞培养环境控制光照 温度pH气体温度第44页/共61页光照包括：光周期、光量和光质三方面。光量指的是光照强度，因植物类型不同而异。离体培养条件下常用的光量一般为10004000lx。光质即是光的波长的影响。离体培养下一般用白炽荧光灯进行光照，光谱成分主要是蓝光，光谱波长为419nm。在离体培养中，根、芽分化的依赖光谱成分不同。光周期指的是光照和黑暗交替的时间，影响细胞脱分化和再

16、分化的效应。第45页/共61页 温度控制主要依据植物物种的起源和生态类型来决定。依植物生活习性可将其分为喜温性植物和冷凉性植物两大类型。喜温性植物培养温度一般控制在26-280C，冷凉性植物培养温度一般控制在18-220C或低于250C为宜。第46页/共61页 在在大大多多数数情情况况下下，适适温温有有利利于于细细胞胞分分裂裂，即即可可以以提提高高细细胞胞分分裂裂速速率率，而而适适当当提提高高温温度度则则有有利利于于细细胞胞生生长长，在在一一定定范范围围内内降降低低培培养养温温度度则则使使细细胞胞分裂和生长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。分裂和生长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。第47页/

17、共61页 湿湿度度条条件件：培培养养过过程程对对湿湿度度要要求求并并不不十十分分严严格格，因因为为培培养养的的小小环环境境中中相相对湿度常达对湿度常达110%。周周围围环环境境的的相相对对湿湿度度低低于于60%时时，培培养养基基容容易易干干涸涸，会会改改变变培培养养基基的的渗渗透压；相反，若周围环境湿度过高时，培养室易滋生各种细菌和霉菌。透压；相反，若周围环境湿度过高时，培养室易滋生各种细菌和霉菌。周围环境较适宜的相对湿度为周围环境较适宜的相对湿度为7080%。第48页/共61页 植物培养通常使用的pH值范围是5.56.5。pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。由于外植体的吸收，引

18、起培养过程中的pH变化；高压灭菌引起pH 变化。第49页/共61页 总总体体上上讲讲，动动物物细细胞胞忍忍受受低低温温的的能能力力比比忍忍受受高高温温的的能能力力强强。如如哺哺乳乳低低温温细细胞胞在在45下下只只能能存存活活1小小时时，但但在在25条条件件下下仍仍然然能能慢慢速速生生长长，并并维维持持长长时时间间不不死死，甚甚至至在在4下下数数小小时时后后，再再置置于于适适宜宜温温度度下下细细胞胞仍仍然然可可以以正正常常生生长。长。动物细胞培养环境控制动物细胞培养环境控制第50页/共61页2.pH2.pH动动物物细细胞胞培培养养适适宜宜的的pHpH一一般般在在7.2-7.47.2-7.4，低低

19、于于6.86.8或或高高于于7.67.6都都不不利利于于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。细胞生长，严重时会导致细胞死亡。培培养养细细胞胞对对pHpH的的要要求求因因培培养养时时间间长长短短有有关关，一一般般原原代代细细胞胞要要求求较较严严格格，而而永久细胞系对永久细胞系对pHpH具有较强的忍耐性。具有较强的忍耐性。第51页/共61页3.3.溶氧及气体环境溶氧及气体环境一一般般细细胞胞在在培培养养初初期期要要求求较较低低的的溶溶氧氧水水平平，而而在在对对数数生生长长期期或或培培养养后后期期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而

20、死亡。除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和COCO2 2的平衡。的平衡。第52页/共61页4.4.渗透压渗透压动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题：动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题：一是培养基的渗透压维持；一是培养基的渗透压维持；二细胞体内的渗透压维持。二细胞体内的渗透压维持。大大多多数数动动物物细细胞胞对对渗渗透透压压的的忍忍耐耐程程度度较较强强，只只要要培培养养基基的的渗渗透透压压变变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶

21、液。第53页/共61页1.5 1.5 外植体接种培养外植体接种培养植物离体培养类型：组织培养 器官培养 细胞培养 原生质体培养第54页/共61页植物材料的培养与外植体选取 外植体灭菌接种培养及培养条件的控制植物离体培养基本程序第55页/共61页外植体的来源外植体的来源 外外植植体体（explantexplant）是是指指用用于于离离体体培培养养的的活活的植物组织、器官等材料。的植物组织、器官等材料。用用于于外外植植体体分分离离的的母母体体植植物物材材料料一一般般有有三三种来源：种来源：u一是生长在自然环境下的植物；一是生长在自然环境下的植物；u二是有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物；二

22、是有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物；u三是无菌环境下已经过离体培养的植物。三是无菌环境下已经过离体培养的植物。第56页/共61页外植体取材外植体取材 a.a.根据培养需求选择植物部位根据培养需求选择植物部位 b.b.多年生植物注意树龄和季节多年生植物注意树龄和季节 c.c.在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体第57页/共61页外植体灭菌外植体灭菌外植体清洗整理杀菌剂灭菌无菌水清洗不同外植体 在灭菌剂浓度、时间、程序上 应有所区别第58页/共61页几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较消消 毒毒 剂剂使用

23、浓度使用浓度(%)(%)消毒时消毒时间间(min.)(min.)效效 果果残液去残液去除难易除难易次氯酸钙次氯酸钙/纳纳10105 53030好好易易新洁尔灭新洁尔灭101020205 53030好好易易氯化汞氯化汞0.10.11 12 21010最好最好最难最难过氧化氢过氧化氢101012125 51515较好较好最易最易抗菌素抗菌素4 450mgl50mgl-1-130306060较好较好较难较难第59页/共61页课后思考请思考细胞工程实验技术与其它生物技术实验请思考细胞工程实验技术与其它生物技术实验不同之处。不同之处。植物细胞培养环境控制应注意哪些方面？植物细胞培养环境控制应注意哪些方面？动植物细胞培养基的主要成分分别包括哪些？动植物细胞培养基的主要成分分别包括哪些？就本章知识，分析动植物细胞培养的区别。就本章知识，分析动植物细胞培养的区别。第60页/共61页感谢您的观看！第61页/共61页