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1、1 1 实验室设置及仪器设备实验室设置及仪器设备2 2 实验基本操作实验基本操作3 3 培养基的成分及其配制培养基的成分及其配制4 4 培养条件的选择培养条件的选择植物细胞工程实验室及基本操作植物细胞工程实验室及基本操作1 1 实验室设置及仪器设备实验室设置及仪器设备 实验室是进行组培研究的主要场所，应实验室是进行组培研究的主要场所，应能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌操作、培养、鉴定等多方面的工作。操作、培养、鉴定等多方面的工作。1 1基本实验室基本实验室1.1 1.1 洗涤间洗涤间 根据工作量的大小决定其大小，一般面积控根据工作量的大小决定其大小，一般面积
2、控制在制在30-50m30-50m2 2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2 2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备可以购置一台洗瓶机。准备1-21-2个洗液缸，专门个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。地面应耐湿并排水良好。地面应耐湿并排水良好。面积面积60平方米
3、左右，配备的主要仪器设备有平方米左右，配备的主要仪器设备有：冰：冰箱、天平、微波炉、箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、药品计、培养基分装器、药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积等。冰箱以体积180-200L为宜，用于储存培养基为宜，用于储存培养基母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保存植物材料。天平应有不同感量。存植物材料。天平应有不同感量。1.2培养基配制间培养基配制间 配备实验台、高压灭
4、菌锅、排风灭火设备、细配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。如果没有条件的话，可以将上述工作间合并如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成一个准备间，要求是设备的安装和排
5、列要合理、成一个准备间，要求是设备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。1.3 消毒间消毒间无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设菌室不因开门和人的进
6、出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种接种器械等。接种器械等。1.4 无菌操作室无菌操作室 为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上
7、排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。室外应有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W，固定，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距在培养架的侧面或搁板的下面
8、，每层有两支日光灯，距离在离在20cm，光照强度为，光照强度为2000-3000lx。1.5 培养室培养室2 2辅助实验室辅助实验室 2.12.1鉴定室鉴定室 细胞学鉴定室细胞学鉴定室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。系统等。生化分析室生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培室中，应建立相应的分析化验实验室
9、，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。养物的有效成分随时进行取样检查。离心机、酶联离心机、酶联免疫检测仪、天平、免疫检测仪、天平、PCRPCR仪等。仪等。为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。2.2、温室、温室(1)(1)洗涤液的洗涤液的配制配制2 2 实验基本操作实验基本操作一一.洗涤技术洗涤技术A A、新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用质，可先用0.5的去污剂洗刷，再用自来水洗净，的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在然后浸泡在12盐酸溶液中过夜（不可少于盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用
10、自来水冲洗，最后用无离子水冲四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在洗两次，在100120烘箱内烘干备用。烘箱内烘干备用。(2)(2)洗涤方法洗涤方法 先用自来水洗刷至无污物，再用合适的先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在0.50.5的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，清洗后器皿内外不可挂有
11、水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。B B、使用过的玻璃仪器的清洗、使用过的玻璃仪器的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化学聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化学实验中已用的越来越多。第一次使用塑料器皿时，实验中已用的越来越多。第一次使用塑料器皿时，可先用可先用8mol/L尿素（用浓盐酸调尿素（用浓盐酸调pH=1）清洗，接）清洗，接着依次用无离子水、着依次用无离子水、1 mol/L KOH和无离子水清洗，和无离子水清洗，然后用然后用103 mol/L EDT
12、A 除去金属离子的污染，最除去金属离子的污染，最后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用0.5的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。即可。C、塑料器皿的清洗塑料器皿的清洗金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。般用酒精擦洗，然后火焰干燥。E E、除菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，、除菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备再用清
13、水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。用。D D、金属用品洗涤、金属用品洗涤（一）、灭菌工作是极其重要的。（一）、灭菌工作是极其重要的。首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴：首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴：有菌：有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。无菌无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）物理或化学处理；物理或化学处理；火烤后的物体；火烤后的物体；健康的动植物不与内外部表面接触的组织健
14、康的动植物不与内外部表面接触的组织 内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但 不会影响培养，也不会污染）不会影响培养，也不会污染）二二.灭菌灭菌1 1、物理方法物理方法：干热、湿热、过滤（：干热、湿热、过滤（0.250.25微微米）紫外灯、超声波等。米）紫外灯、超声波等。2 2、化学方法化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等双氧水、福尔马林等 （二）、灭菌的方法（二）、灭菌的方法干热灭菌干热灭菌 玻璃器皿、器械玻璃器皿、器械 湿热灭菌湿热灭菌 培养
15、基、蒸馏水、器械、棉塞等培养基、蒸馏水、器械、棉塞等熏蒸灭菌熏蒸灭菌 接种室、培养室接种室、培养室过滤灭菌过滤灭菌 液体培养基、蒸馏水液体培养基、蒸馏水药剂灭菌药剂灭菌 培养材料培养材料烧灼灭菌烧灼灭菌 器械、瓶口、棉塞、包头纸器械、瓶口、棉塞、包头纸辐射灭菌辐射灭菌 接种室。培养间接种室。培养间各种灭菌方法及其使用范围各种灭菌方法及其使用范围适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：法：150 150、40min40min或或120 120、120min120min，如，如果发现芽孢杆菌，果发现芽孢杆菌，160 160、9090120min120min（
16、1 1）干热灭菌）干热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。棉塞、纸等。121 121 维持维持202030min30min注意点：加足水、排尽气、气压降到注意点：加足水、排尽气、气压降到0 0时，时，才能开盖才能开盖（2 2）湿热灭菌）湿热灭菌 培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌清等也需要过滤灭菌
17、灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.220.220.450.45微微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至5050左右时，加入适量的激素，然后分装。左右时，加入适量的激素，然后分装。（3 3）过滤灭菌）过滤灭菌主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间空气、操作台等，灭菌时间202030min30min。注意：关灯后注意：关灯后5min5min后再进入。超净工作台后再进入。超净工作台关
18、灯后要打开风机。关灯后要打开风机。（4 4）射线灭菌）射线灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。接种器皿的灭菌。（5 5）火焰灼烧灭菌）火焰灼烧灭菌适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较消消 毒毒 剂剂使用浓度使用浓度(%)(%)消毒时间消毒时间(min.)(min.)效效 果果残液去除残液去除难易难易乙醇乙醇70-7570-750.1-30.1-3好好易易新洁尔灭新洁尔灭101020205 53030好好易易氯化汞氯化汞0.10.11 12 21515最好最好最
19、难最难过氧化氢过氧化氢101012125 51515较好较好最易最易抗菌素抗菌素4 450mgl50mgl-1-130306060较好较好较难较难次氯酸钙次氯酸钙/纳纳9 9 10105 53030好好易易（6 6）消毒剂）消毒剂长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲甲醛、高锰酸钾熏蒸醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每立方米空间甲醛的用量通常按每立方米空间2-62-6毫升计算，毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在
20、碗或最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。醛挥发为气体。熏蒸灭菌熏蒸灭菌甲醛熏蒸接种室应至少在使用前甲醛熏蒸接种室应至少在使用前2424小时进行，熏蒸后小时进行，熏蒸后密闭保持密闭保持4 4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼
21、、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2 2小时进行。小时进行。对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素物品
22、因素器器皿皿和和用用具具培养皿：洗培养皿：洗热压热压 玻璃器皿：洗玻璃器皿：洗干热（干热箱）或晾干干热（干热箱）或晾干 接种用具：用接种用具：用CCLCCL4 4布擦布擦湿布擦湿布擦 泡泡75%95%75%95%酒精酒精烧烧培养基：湿热培养基：湿热培培养养材材料料外部细菌：用水冲洗外部细菌：用水冲洗化学药剂处理化学药剂处理 内部细菌内部细菌 茎尖培养茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸用化学试剂薰蒸污染来源污染来源三、无菌操作技术三、无菌操作技术1 1、实验器具和材料的准备、实验
23、器具和材料的准备2 2、用、用75%75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌净工作台用紫外灯杀菌20min-30min20min-30min。注意：台面。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。菌效果。3 3、关紫外灯、打开风机，过、关紫外灯、打开风机，过5-10min5-10min进入缓冲间，进入缓冲间，以以75%75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工
24、作台）作台）4 4、用、用70707575的酒精拭擦台面并消毒双手。试验的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。长。5 5、取流水冲洗（至少、取流水冲洗（至少30min30min）过的外植体，用一定
25、）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3434次，放入无菌次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。械进行分离、切割或其他处理。6 6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。灼烧瓶口，盖上瓶塞。7 7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。注意（注意（1 1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又
26、不必）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（太快，以防空气流动，增加污染机会。（2 2）不能用）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。取备品更换。（3 3）为拿取方便，工作台面上的用品）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4 4）工）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理
27、之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。即封闭瓶口直立可增加落菌机会。（5 5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。胞交叉污染。（6 6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。把细菌或支原体带入工作
28、台面发生污染。（7 7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。管丢掉。接种接种时在近火焰在近火焰处打开瓶口，使瓶打开瓶口，使瓶倾斜，斜，以免空气中微生物落入瓶中以免空气中微生物落入瓶中正正 确确 错 误整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速迅速正正 确确 错 误接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作防止操作带来的来的污染染正正 确确 错 误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正正 确确 错 误瓶盖朝上放，接种完毕
29、后立即盖好瓶口正正 确确 错 误接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生种子和分生种子和分生组织：培养：培养时通常将其通常将其贴放在培养基表放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足正正 确确 错 误接种茎段：注意形接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中学上端露于空气中正正 确确 错 误用于外植体分离的母体植物材料一般有用于外植体分离的母体植物材料一般有3种来源：种来源：一是一是生长在自然环境下的植物生长在自然环境下的植物；二是；二是在温室控制在温室控制环境条件下生长
30、的植物环境条件下生长的植物；三是；三是无菌环境下已经过无菌环境下已经过离体培养的植物离体培养的植物。四、外植体的选择与处理技术四、外植体的选择与处理技术 1 1、选择优良的基因型、选择优良的基因型 试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快繁，也应选择有价值的植物。繁，也应选择有价值的植物。2 2
31、、取材、取材 从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母柱代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容母柱代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容易成功。易成功。（一）、外植体的选择（一）、外植体的选择3 3、外植体大小选择、外植体大小选择 因外植体不同而不同。如利用茎尖培养，因外植体不同而不同。如利用茎尖培养，茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，胚龄也非常重要。（以后具体讲）胚龄也非常重要。（以后具体讲）4 4、选择外植体的时期、选择外植体的时期 外植体的生长动态往往与该物种的生长规律外植体的生长动态往往与该
32、物种的生长规律（生物钟）有关。因此，最好在植物生长的最适（生物钟）有关。因此，最好在植物生长的最适宜时期取材培养。会得到较好的结果。宜时期取材培养。会得到较好的结果。1 1、取材母株的预处理取材母株的预处理 人工管理，促进母株生长旺盛、代谢活跃，从其人工管理，促进母株生长旺盛、代谢活跃，从其上取材培养，容易成功。上取材培养，容易成功。2 2、外植体休眠的处理外植体休眠的处理 有些植物的种子、幼胚、或芽，存在休眠。为了有些植物的种子、幼胚、或芽，存在休眠。为了打破休眠，可利用低温处理，或赤霉素等化学物质打破休眠，可利用低温处理，或赤霉素等化学物质处理。因植物不同处理温度和时间有所不同。处理。因植
33、物不同处理温度和时间有所不同。（二）、外植体的处理（二）、外植体的处理3 3、组织内生菌的处理组织内生菌的处理 （1 1）加入抗生素，注意抗生素的用量，）加入抗生素，注意抗生素的用量，高浓度容易造成培养物的死亡高浓度容易造成培养物的死亡 （2 2）取生长期旺盛的生长点部位作为）取生长期旺盛的生长点部位作为起始培养的外植体。起始培养的外植体。（3 3）取被内生菌污染的培养物的）取被内生菌污染的培养物的 茎尖茎尖不停的转接。不停的转接。3.3.培养基的成分及其配制培养基的成分及其配制一、培养基的成分及其作用一、培养基的成分及其作用（一）（一）无机营养物质无机营养物质 培养的植物组织、器官、细胞或者
34、原生质体需培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质，除了要连续的供给某些无机化学物质，除了C C、H H、O O之外，之外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的元素叫微量营养元素。元素叫微量营养元素。培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,SN,P,K,Ca,Mg,S。培养基中加入量最多的是培养基中加入量最多的是N N，N N一般以硝酸盐或氨一般以硝酸盐或氨盐，或者两者结合的盐提供盐，或者两者结合的盐提供大量元素
35、大量元素微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所需的微量元素有需的微量元素有FeFe、CuCu、ZnZn、B B、MoMo、MnMn、CoCo，ClCl其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等毒害现象。毒害现象。微量元素微量元素（二）（二）.有机化合物有机化合物有机物质包括维生素类物质、氨基酸类物质、糖类物有机物质包括维生素类物质、氨基酸类物质、糖类物质和一些其它的有机添加物质和一些其它的有机添加物1、维生素类物
36、质、维生素类物质 维生素类物质在酶系统中有催化功能。维生素类物质在酶系统中有催化功能。硫胺素（硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸吡哆醇（吡哆醇（VB6）促进根的生长，烟酸（）促进根的生长，烟酸（VB3，又称，又称维生素维生素PP）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛酸钙（酸钙（VB5）、生物素（）、生物素（VH）、钴胺素（）、钴胺素（VB12）、）、叶酸（叶酸（VBc），），Vc等。等。2、AA类物质类物质绝大多数绝大多数AA
37、适量时对培养效果都有正象效应。常用适量时对培养效果都有正象效应。常用的有的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中，有时也。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。用水解乳蛋白和水解酪蛋白。3 3、糖类、糖类糖在培养基的作用：糖在培养基的作用：1 1）、为细胞提供合成新物质的碳骨架）、为细胞提供合成新物质的碳骨架 2 2）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3 3）、维持渗透压）、维持渗透压蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。用的碳源。4、其它有机物质、其它有机物质1）肌醇（环己六醇）
38、肌醇（环己六醇）肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成2）天然有机物天然有机物一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好的促进作用。现出了良好的促进作用。n植物激素是在植物体内合成的，对植物植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育有显著调节作用的微量有机物，生长发
39、育有显著调节作用的微量有机物，而而植物生长调节植物生长调节剂是外源的调节植物生剂是外源的调节植物生长发育的物质。长发育的物质。n无机元素和有机营养构成的培养基仅保无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活动，只有证培养物的生存与最低生理活动，只有加入植物生长调节物质，才能诱导细胞加入植物生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。分裂、脱分化和再分化。（三）、植物生长调节物质（三）、植物生长调节物质 1 1、生长素类：、生长素类：1 1）吲哚类：）吲哚类：IAAIAA（吲哚乙酸）、（吲哚乙酸）、IBAIBA（吲哚丁酸）（吲哚丁酸）、IPAIPA（吲哚丙酸）（吲哚丙酸）2
40、2）萘酸类：）萘酸类：NAANAA（萘乙酸）（萘乙酸）3 3）苯氧羧酸类：）苯氧羧酸类：2,4-D2,4-D（2,4-2,4-二氯苯氧乙酸）、二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T2,4,5-T（2,4,5-2,4,5-三氯苯氧乙酸）、三氯苯氧乙酸）、2,4,5-T2,4,5-TP P（2,4,5-2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。三氯苯氧丙酸）等。其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。强的生长素。生长素的生理作用生长素的生理作用1 1、促进细胞生长和细胞分裂、促进细胞生长和细胞分裂2 2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力、诱导受伤组织表面细胞
41、恢复分裂能力3 3、形成愈伤组织，促进生根、形成愈伤组织，促进生根4 4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。导。A A：NAA 0mg/LNAA 0mg/L，芽（少），根（无），芽（少），根（无）B B：NAA 0.1mg/LNAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量），芽（少），根（无），愈伤组织（少量）C C：NAA 5.0mg/LNAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量A B C2、细胞分裂素、细
42、胞分裂素n是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（6-6-糠糠基氨基嘌呤基氨基嘌呤KTKT）、）、6-6-苄基氨基嘌呤（苄基氨基嘌呤（6-BA6-BA）和）和玉米素（玉米素（ZTZT）等。其中最常用的是）等。其中最常用的是66苄基氨苄基氨基嘌呤。基嘌呤。n功能：功能：1 1、促进细胞的分裂和分化、促进细胞的分裂和分化2 2、诱导芽的分化、诱导芽的分化3 3、促进侧芽的萌发和生长、促进侧芽的萌发和生长4 4、抑制衰老、抑制衰老A BA A：BA(0mg/L)BA(0mg/L)，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量），芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）B B：B
43、A(0.1mg/L)BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量），芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）控制植物细胞分化控制植物细胞分化n分裂素分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件的一个重要条件n比例高时比例高时产生芽产生芽,比例低时比例低时产生产生根根生理作用：生理作用：1 1、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效型特别有效，对根无效2 2、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。协同作用。IAA/GAIAA/G
44、A比值高有利于木质部的分化，比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。比值低有利于韧皮部的分化。3 3、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。4 4、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用注：不耐热，应采用过滤灭菌加入注：不耐热，应采用过滤灭菌加入3 3、赤霉素（、赤霉素（GAGA3 3）生理作用生理作用：1 1、抑制蛋白质的合成、抑制蛋白质的合成2 2、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GAGA的作的作用用3 3、诱导休眠、促进衰老和脱落、诱导休眠、促进衰老和脱落 4 4、脱落
45、酸（、脱落酸（ABAABA）以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，还有害，实际工作中要具体分析。还有害，实际工作中要具体分析。生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一般用般用ppm表示表示 1ppm=1mg/L1 1、固化剂、固化剂 琼脂、琼脂糖（用于原生质体、细胞培养及某些琼脂、琼脂糖（用于原生质体、细胞培养及某些作物的花药培养）作物的花药培养）琼脂的用量一般在琼脂的用量一般在4-10g/L4-10g/L
46、，所购回的琼脂要先，所购回的琼脂要先试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。2 2、悬浮剂、悬浮剂FicollFicoll（聚蔗糖）（聚蔗糖）（四）固化剂和悬浮剂（四）固化剂和悬浮剂培养基的种类（根据无机盐的浓度）：培养基的种类（根据无机盐的浓度）：1、高无机盐含量培养基、高无机盐含量培养基 钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性
47、，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有MS、LS、BL、BM、ER培养基。培养基。二、培养基的配方及培养基的选择二、培养基的配方及培养基的选择2、高硝态氮培养基、高硝态氮培养基 硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的的VB1。主要适合与木本植物、十字花科植物和。主要适合与木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有单子叶植物的组织和花药培养。主要有B5、N6、SH培养基。培养基。3、中等无机盐含量培养基、中等无机盐含量
48、培养基大量元素约为大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较但含量较MS的高，维生素种类比的高，维生素种类比MS多，如增加了多，如增加了生物素、叶酸等。适合于花药培养，主要有生物素、叶酸等。适合于花药培养，主要有Nitch，NT、H、Miller培养基。培养基。4、低无机盐含量培养基、低无机盐含量培养基大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也很低。多数用于生根培养基，主要有相对也很低。多数用于生根培养基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。初代培养基初代培养基：用来第一次接种外植体
49、的培养基：用来第一次接种外植体的培养基继代培养基继代培养基：用来接种继初代培养物的培养基。：用来接种继初代培养物的培养基。根据培养物的培养过程，培养基分为：根据培养物的培养过程，培养基分为：根据其作用不同，培养基分为：根据其作用不同，培养基分为：诱导培养基诱导培养基增殖培养基增殖培养基生根培养基生根培养基4、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。养基和完全培养基。基本培养基基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有（就是通常称呼的培养基）主要有MSMS、WhiteWhite、N6N6、B5 B5、改良、改良MSMS、HellerHeller
50、、NitshNitsh、SHSH、MillerMiller等。等。完全培养基完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。其他复杂有机物质等。MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5+Su3%+Ag0.7%MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5+Su3%+Ag0.7%1 1.无机营养成分无机营养成分：一般在现有培养基配方中选择。可以参考：一般在现有培养基配方中选择。可以参考前人的经验，例如：前人的经验，例如：MSMS是广谱性培养基，是广谱性培养基，N