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1、第一章 基本设备和实验技术一、一、实验室设置实验室设置基基本本实实验验室室辅辅助助实实验验室室实验准备,培养基的配制,洗涤与灭菌等离体材料的无菌操作,又称接种室控制条件下的离体培养常规设备：常规设备：天平、冰箱、酸度计、离心机、天平、冰箱、酸度计、离心机、纯水器纯水器 二、实验室所需的设备、用具实验室所需的设备、用具灭菌设备：灭菌设备：高压灭菌锅、干热消毒柜高压灭菌锅、干热消毒柜 过滤灭菌装置过滤灭菌装置 二、实验室所需的设备、用具实验室所需的设备、用具培培养养容容器器：培培养养瓶瓶、培培养养皿皿等等 二、实验室所需的设备、用具实验室所需的设备、用具无菌操作设备：无菌操作设备：超净工作台超净工
2、作台 二、实验室所需的设备、用具实验室所需的设备、用具接种器具：接种器具：镊子、剪刀、解剖刀等镊子、剪刀、解剖刀等 二、实验室所需的设备、用具实验室所需的设备、用具cm60cm14cm定时器定时器培养设备：培养设备：培养箱、培养架等培养箱、培养架等三、常用技术无菌接种技术无菌接种技术灭菌技术灭菌技术洗涤技术洗涤技术（一）洗涤技术新购玻璃器皿的洗涤：1%HCl浸泡过夜 洗衣粉刷洗 自来水冲洗 蒸馏水漂洗使用过的玻璃器皿的洗涤：去除酸洗步骤，其它同上有污染物的玻璃培养器皿：高压灭菌 洗衣粉刷洗 自来水冲洗 蒸馏水漂洗金属器具：用酒精擦洗，并保持干燥。（二）灭菌技术1)接种室的灭菌接种室灭菌接种室灭
3、菌紫外灯照射紫外灯照射(无菌室、超净台)：波长260nm，距离小于1.2m，15-30min。每周一次.熏蒸灭菌熏蒸灭菌(无菌室):100ml/20m2甲醛+5g/20m2 高锰酸钾；新的实验室或长期不用的实验室.湿度较大的季节要定期进行.喷雾消毒喷雾消毒(超净台;无菌室)：75%酒精或3%来苏儿2)接种工具、容器的灭菌干热灭菌：160-180,1.5-2.0h湿热灭菌：121,20-30min在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。3)培养基的灭菌高压
4、湿热灭菌：高压湿热灭菌：121,18-20min液体体积液体体积(mL)所需的时间所需的时间(min)（121）20-501560-15020150-50025500-1000304)不耐热类物质的灭菌过滤灭菌过滤灭菌（Filter sterilization）：某些激素：某些激素（如天然生长素IAA、玉米素ZT、赤霉素GA等）、维生素、抗生素等不耐热或射线照射的物质。Filter sterilization-过滤灭菌过滤灭菌滤膜滤膜0.45m以以下下1.过滤器先灭菌，灭菌温度过滤器先灭菌，灭菌温度121，20min。2.细菌滤膜的网孔直径一般细菌滤膜的网孔直径一般小于小于0.45m和和0.2
5、2mFilter sterilization灭菌的原则灭菌的原则：消毒剂与外植体应接触足够长的时间以除去外植体表面的微生物，但应尽量减少对外植体细胞的破坏。4)外植体的灭菌常用外植体常用外植体灭菌步骤灭菌步骤 冲洗植物材料除去泥土等大的颗粒；切成适宜的大小;浸入70-75乙醇，0.5-1min；用2-5NaClO溶液（加1滴表面活性剂）表面 消毒5-30min；或HgCl2(0.1 0.2%)2-10 min 用无菌水冲洗至少3遍,每次1-2min;灭菌的材料可用无菌纸吸干。（三）无菌接种技术1.外植体的选择外植体的选择常用外植物体的来源自然环境下自然环境下生长的植物生长的植物无菌环境下无菌环
6、境下生长的植物生长的植物温室环境下温室环境下生长的植物生长的植物1.外植体的选择 来源：健壮、无病虫害、发育正常 大小：视培养目的而定部位（生理状态及发育年龄）取材季节：生长开始的季节。（苹果）组织清洗 70%酒精浸1030s 灭菌剂处理 无菌水涮洗 Note:此步骤应在超净台上完成2 2、外植体无菌处理、外植体无菌处理3、无菌接种接种前的准备酒精擦拭酒精擦拭旋转灼烧旋转灼烧取外植体取外植体接种接种盖好瓶塞盖好瓶塞修剪外植体修剪外植体接种培养物污染可能的原因培养物污染可能的原因 培养容器培养容器 培养基本身培养基本身 外植体外植体 接种室的环境接种室的环境 操作用的器械操作用的器械 培养室的环境培养室的环境 操作过程操作过程首次接种降低污染率的对策首次接种降低污染率的对策首次接种：小容器，多数量，尽量分散，互相隔离，效果最好。录相:菊花的组织培养(上)