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1、 学习的目标与要求：学习的目标与要求：了解细胞工程实验室的组成及所需的各种实验仪器，掌握细胞工程中各种实验仪器的操作及无菌操作技术，了解细胞工程所用培养基的组成成分及配制。第1页/共67页基本实验室辅助实验室实验室组成准备室（通用实验室）缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实验室温 室生化分析实验室第一节 细胞工程实验室组成第2页/共67页一、实验室组成一、实验室组成1 1、组成、组成 化学实验室、洗涤室、无菌操作室（接种室）、培养室、细胞学实验室和温室或大棚等。第3页/共67页（1 1）化学实验室（准备室）：）化学实验室（准备室）：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。主要
2、设备：药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器。第4页/共67页（2 2）洗涤、灭菌室：）洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭菌器（如烘箱）等。第5页/共67页（3 3）无菌操作室（接种室）无菌操作室（接种室）：主要用于动植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。第6页/共67页（4 4）培养室：）培养室：培养室是将接种的材料进行
3、培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设4-5层，最低一层离地高约l0cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。第7页/共67页 培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室
4、内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h，也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。主要设备：主要设备：培养架（控温控光控湿）培养架（控温控光控湿）、摇床、培养箱、紫外光摇床、培养箱、紫外光源等。源等。第8页/共67页二、基本设备及使用二、基本设备及使用1 1、接种设备：无菌超净工作台 用于培养材料的消毒及接种。使用前，将超净工作台上面的排风
5、和杀菌按钮开启，灭菌15min后，关闭杀菌按钮，打开照明按钮，即可在上面进行操作。第9页/共67页 超净工作台超净工作台第10页/共67页超净工作台使用注意事项超净工作台使用注意事项 1 1、使用超净工作台前，应提前开机并开启紫外灭菌灯30分钟以上。2 2、使用超净工作台时，关闭紫外灭菌灯，开启日光灯，并用70%75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。3 3、操作区不允许放置不必要的物品，保持洁净、气流通畅。整个实验过程中，实验人员应按照无菌操作规程操作。4 4、使用完毕，应擦净工作台面。第11页/共67页2 2、高压蒸气灭菌锅 用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。第12页/共
6、67页(1)(1)高压蒸气灭菌锅工作原理：在密闭的蒸锅内，0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。第13页/共67页(2)(2)使用方法：首先检查灭菌锅内是否有水，而且水刚好淹住加热器，然后放入灭菌材料，对称拧紧灭菌锅上的螺丝，关闭放气阀通电。待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0.1-0.15Mpa时，维持20min后，断电，待压力降至零时，打开入气阀，取出灭菌材料。第14页/共67页(3)(3)注意事项：对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、
7、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间；对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min；第15页/共67页高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单位。因此，调PH值时，可适当调高0.10.3个单位。接通电源前一定要加入足量的水。第16页/共67页电炉推车酒精灯封口膜接种器具灭菌器培养瓶3 3、相关仪器 第17页/共67页4、接种工具镊子解剖刀接种针酒精灯第18页/共67页5 5、培养设备带日光灯的培养架，主要用于接种后材料的培养。第1
8、9页/共67页恒温箱：又称培养箱，可用于原生质体和酶制剂的保温，也可用于组织培养材料的保存及暗培养。第20页/共67页摇床与转床：在液体培养基中，可改善培养基中的培养材料的通气状况。如从疏松的愈伤组织中获得单个细胞。但注意要设定适合的温度及转速。第21页/共67页恒温振荡培养箱 光照培养箱 第22页/共67页6、细胞培养设备 摇 床第23页/共67页光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜7 7、细胞学鉴定设备第24页/共67页分注器血球计数器移液器磁力搅拌器低速台式离心机第25页/共67页8、其它辅助设备培养基灌装机及洗瓶机第26页/共67页 除湿机：使培养室的湿度保持在定
9、的范围内。空调机：用于接种室和培养室温度的控制。第27页/共67页烘箱：用于干燥洗净后的玻璃器皿，还可用80的温度烘干组织培养植物材料以测定干物质。冰箱：用于在常温下易变性或失效的试剂和母液的储藏，细胞组织和试验材料的冷冻保藏，以及某些材料的预处理。第28页/共67页纯水机与蒸馏水发生器第29页/共67页天平：天平包括分析天平，电子天平，药物天平等，用于制备母液时培养基组成成分的称取。如一些需要量少的激素和微生素类物质，天平的精确度要到0.0001g，这就要求精确度更高的分析天平。第30页/共67页酸度计：用于校正培养基和酶制剂的PH。第31页/共67页温室（大棚）：温室（大棚）：第32页/共
10、67页第二节 无菌操作技术一、实验仪器及洗涤二、常用灭菌和消毒方法第33页/共67页1、玻璃器皿的选择与清洗培养皿三角瓶培养瓶试管一、实验仪器及洗涤第34页/共67页不锈钢锅磨口瓶烧杯滴瓶第35页/共67页量筒滴定管容量瓶第36页/共67页2 2、玻璃器皿洗涤（*注意污染的玻璃器皿 P14 P14）新购置玻璃器皿1%稀HCl浸渍12h12h洗衣粉洗涤清水冲洗晾干备用已用过的玻璃器皿第37页/共67页3、塑料用品洗涤新的塑料器皿打开即用已用过的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水冲洗2%5%盐酸浸泡30min清水冲洗蒸馏水冲洗晾干备用第38页/共67页4 4、金属用品洗涤热洗衣粉水洗净冲洗擦干第3
11、9页/共67页二、灭菌和消毒方法1、灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。2、灭菌方法 物理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等 化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌第40页/共67页3、灭菌（1 1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在9.810410.8104Pa温度在 121灭菌1530min（2 2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌第41页/共67页（3）接种室灭菌空气消毒灭菌接种室超净工作台紫外灯照射70%75%的酒精擦洗培养材料的接种紫外灯照射第42页/共67页三、实验室常用的消毒与灭菌技术三、实验室常用的消毒与灭
12、菌技术1 1、物理方法、物理方法（1 1）湿热灭菌（培养基）湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。第43页/共67页 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀
13、。关阀再通电后，压力表上升达到01MPa时压力0.1-0.15MPa，20min。第44页/共67页 （2 2）灼烧灭菌）灼烧灭菌（用于无菌操作的器械用于无菌操作的器械 ）在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。第45页/共67页（3 3）干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到160-180 的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170持续90min
14、来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新第46页/共67页 污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。第47页/共67页（4 4）过滤灭菌（不耐热的物质）过滤灭菌（不耐热的物质 ）一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。防细菌滤膜的网孔的直径为0.45m以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直
15、径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。第48页/共67页（5 5）紫外线和熏蒸灭菌（空间）紫外线和熏蒸灭菌（空间）紫外线灭菌紫外线灭菌 :在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求
16、距照射物以不超过1.2m为宜。第49页/共67页熏蒸灭菌熏蒸灭菌 ：用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按58mlm3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。第50页/共67页 化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂
17、必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。第51页/共67页（6 6）喷雾灭菌（物体表面）喷雾灭菌（物体表面）物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%1%的新洁尔灭也可以。第52页/共67页2 2、化学方法灭菌剂灭菌剂使用浓度使用浓度(%)(%)持续时间（持续时间（minmin）去除的难易去除的难易效果效果次氯酸钙次氯酸钙910910530530易易很好很好次氯酸钠次氯酸钠2 2530530易易很好很好氯化汞氯
18、化汞0.110.115858较难较难最好最好抗菌素抗菌素450mg/L450mg/L30603060中中较好较好常用灭菌剂使用浓度及效果比较表第53页/共67页3 3、无菌操作技术、无菌操作技术（1 1）实验器具和材料的准备（2 2）用70%的酒精擦拭超净工作台，开净 化工作台和 室内紫外灯。（3 3）关紫外灯、打开风机，过510分钟进入缓冲间。（4 4）用70%的酒精擦拭台面并消毒双手及实验用具（5 5）进行外植体的分离与接种（6 6）完成工作后清理工作台上的废弃物，用70%的酒精擦拭台面和双手第54页/共67页第三节第三节 培养基组成及其成分培养基组成及其成分一、植物细胞培养基的组成成分植
19、物细胞培养基的组成成分二、动物细胞培养基的组成、常用培养基类动物细胞培养基的组成、常用培养基类 型、常用溶液型、常用溶液第55页/共67页1 1、无机化合物、无机化合物 大量元素(major element)：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素(minor element)：Fe、B、Zn、Cu、Mn、Co、Mo2 2、有机化合物、有机化合物（1 1）维生素：）维生素：直接参与酶的形成以及蛋白质、脂肪的代谢，常用的有维生素VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、VB3（烟酸）、VB9(叶酸)、肌醇以及维生素C(抗坏血酸)等（2 2）氨基酸：）氨基酸：甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺
20、等（3 3）其他有机附加物：）其他有机附加物：水解酪蛋白（CH）、椰子汁（CM）、麦芽浸出物（ME）、酵母浸出物（YE）等一、植物细胞培养基的组成成分第56页/共67页3 3、碳源和能源、碳源和能源 常用蔗糖，作为碳源和能源，同时也可维持一定的渗透压；也可用葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等。4 4、植物生长调节物质、植物生长调节物质(Plant growth regulator)(Plant growth regulator)（1 1）生长素类）生长素类(auxin)(auxin)：促进细胞生长和分裂，用于诱导愈伤组织的形成和根的分化，常用的有2,4-D、IAA、NAA和IBA等第
21、57页/共67页（2 2）细胞分裂素类）细胞分裂素类(cytokinin)(cytokinin)：促进细胞分裂；诱导愈伤组织或器官的分 化，常用6-BA、KT、ZT等（3 3）赤霉素类）赤霉素类:常用赤霉酸(GA3)，可促进幼苗茎的伸长生长和胚状体 发育成小植株（4 4）脱落酸）脱落酸（5 5）乙烯）乙烯第58页/共67页5 5、固化剂、固化剂 常用琼脂，一般用量为0.61.0，有时可配成不加固化剂的液体培养基，进行液体浅层培养，液体培养有如下优点：低成本、生长快、移栽成活率高等。6 6、其他成分：、其他成分：活性炭、硝酸银、抗生素等第59页/共67页（一）培养基的成分（一）培养基的成分1 1
22、、糖类：、糖类：作为碳源和能源，主要是葡萄糖，含量一般为 1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）2 2、氨基酸、氨基酸：12种必需氨基酸3 3、维生素：、维生素：包括叶酸、维生素B、烟酰胺和吡哆醇等二、动物细胞培养基的组成、常用 培养基类型、常用溶液第60页/共67页4 4、无机盐类：、无机盐类：大量元素包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO43-等，微量元素包括Cu2+，Zn2+和Mn2+等。5 5、生长类因子及激素：、生长类因子及激素：血清中含有生长因子、促进细胞贴壁的因子、矿物质、激素、脂类等，另外血清可以抑制胰酶的活性。第61页/共67页（二）常用培养基（二）常用培养基1 1、天然
23、培养基：、天然培养基：直接取自动物组织提取液或体液作为培养基，如血清、淋巴液、血浆凝块、水解乳蛋白、胶原等，成分复杂，来源有限2 2、合成培养基：、合成培养基：常用的有BME、MEM、DMEM、IMEM、199、F10、F12、PRMI-1640等，人工设计、化学成分明确，但缺乏各种激素和生长因子，往往需加入5%-10%小牛血清 第62页/共67页3 3、无血清培养基：、无血清培养基：组成成分已知，一般由基础培养基、激素和生长因子、基质三部分组成组成成分已知，一般由基础培养基、激素和生长因子、基质三部分组成 第63页/共67页（三）其他常用溶液（三）其他常用溶液（1）平衡盐溶液平衡盐溶液(BSS)(BSS)：主要由无机盐和葡萄糖配制而成，用于维持细胞的渗透压、维持pH值和细胞正常的代谢等；最常用的有PBS、Earl液和Hanks液。（2）PH调节液：调节液：NaHCO3溶液和HEPES缓冲液第64页/共67页（3）消化液：）消化液：常用的有胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液（4）抗生素溶液：）抗生素溶液：双抗溶液（链霉素、青霉素）第65页/共67页谢谢大家！第66页/共67页感谢您的观看！第67页/共67页