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1、关于免疫学检测技术关于免疫学检测技术的基本原理及其应用的基本原理及其应用第一页，本课件共有45页提提 要要n n免疫学检测技术主要应用：免疫学检测技术主要应用：对多种免疫性疾病的诊断、疗效评估、对多种免疫性疾病的诊断、疗效评估、发病机制探讨发病机制探讨;对抗原性物质、免疫细胞、细胞因子、对抗原性物质、免疫细胞、细胞因子、粘附分子或细胞受体等的定性、定量检测。粘附分子或细胞受体等的定性、定量检测。第二页，本课件共有45页第一节第一节 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测n n 抗原抗原-抗体反应包括：抗体反应包括：沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应、中和反应
2、等。结合反应、中和反应等。n n 抗原抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测抗体反应可用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。抗体。第三页，本课件共有45页第一节第一节 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测n n免疫标记技术包括：免疫标记技术包括：免疫酶技术、免疫荧光技术、同位素标免疫酶技术、免疫荧光技术、同位素标记技术、化学发光免疫技术、免疫胶体金记技术、化学发光免疫技术、免疫胶体金技术等。技术等。第四页，本课件共有45页抗原抗原-抗体反应的特点：抗体反应的特点：P226P226抗原抗原-抗体的特异性结合。抗体的特异性结合。抗原抗体
3、分子表面的非共价键结合。抗原抗体分子表面的非共价键结合。反应的两个阶段：反应的两个阶段：特异性结合阶段；特异性结合阶段；可见的反应阶段。可见的反应阶段。是否呈现可见的反应现象，与抗原和抗体是否呈现可见的反应现象，与抗原和抗体两者的分子浓度和比例密切相关。两者的分子浓度和比例密切相关。第五页，本课件共有45页抗原抗体比例对反应现象的影响抗原抗体比例对反应现象的影响第六页，本课件共有45页抗原抗原-抗体反应的影响因素抗体反应的影响因素n n1 1.电解质电解质：抗原抗原-抗体反应通常应用抗体反应通常应用0.85%0.85%的氯化钠（适当浓度的电解质）作的氯化钠（适当浓度的电解质）作为稀释液。为稀释
4、液。n n2 2.温度温度：反应常在反应常在3737水浴或孵育箱中水浴或孵育箱中进行。进行。n n3.3.酸碱度酸碱度：抗原抗原-抗体反应适应的酸碱度抗体反应适应的酸碱度 为为PH6-8PH6-8。第七页，本课件共有45页抗原抗体的检测方法抗原抗体的检测方法n n凝集反应凝集反应n n沉淀反应沉淀反应n n中和反应中和反应n n用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应第八页，本课件共有45页凝集反应凝集反应(Agglutination)Agglutination)n n 细菌、红细胞等细菌、红细胞等颗粒性抗原颗粒性抗原与相应抗体结与相应抗体结合、凝集的现象。合、凝集
5、的现象。n n1 1、直接凝集：、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法（定性试验）和试管现象。又分为玻片法（定性试验）和试管法（半定量试验）。法（半定量试验）。第九页，本课件共有45页凝集反应凝集反应(Agglutination)Agglutination)n n2 2、间接凝集：、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，形成或乳胶颗粒表面，形成致敏颗粒致敏颗粒，与相应，与相应抗体反应出现的颗粒凝集现象。抗体反应出现的颗粒凝集现象。第十页，本课件共有
6、45页血血 球球 凝凝 集集第十一页，本课件共有45页沉淀反应沉淀反应（Precipitation)Precipitation)血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等等可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉与相应抗体结合后出现沉淀物，称为沉淀反应。淀物，称为沉淀反应。第十二页，本课件共有45页沉淀反应沉淀反应（Precipitation)Precipitation)沉淀反应可在沉淀反应可在液体液体中进行，如絮状中进行，如絮状沉淀。沉淀。大多数沉淀反应是用大多数沉淀反应是用半固体琼脂凝半固体琼脂凝胶胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩
7、散。散。第十三页，本课件共有45页单向免疫扩散单向免疫扩散(Single Immunodiffusion)Single Immunodiffusion)n n将一定量将一定量已知抗体混于琼已知抗体混于琼脂凝胶中脂凝胶中制琼脂板；打孔，制琼脂板；打孔，将将抗原加入孔中扩散抗原加入孔中扩散。n n抗原与抗体相遇，形成抗原与抗体相遇，形成沉沉淀环淀环，环的直径与抗原含，环的直径与抗原含量成正比。量成正比。n n常用于测定血清常用于测定血清IgGIgG、IgMIgM、IgA IgA 和和 C C 3 3等的含量。等的含量。含抗体的凝胶含抗体的凝胶沉淀环沉淀环第十四页，本课件共有45页双向免疫扩散双向免
8、疫扩散 （Double Immunodiffusion)Double Immunodiffusion)n n将抗原与抗体分别加入将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二琼脂凝胶的小孔中，二者自由扩散并相遇，在者自由扩散并相遇，在比例合适处形成比例合适处形成沉淀线沉淀线。n n含两种以上的抗原抗体含两种以上的抗原抗体系统，可出现两条以上系统，可出现两条以上的沉淀线。的沉淀线。n n常用于抗原或抗体的定常用于抗原或抗体的定性性 、组成和两种抗原相、组成和两种抗原相关性分析的检测。关性分析的检测。第十五页，本课件共有45页免疫电泳免疫电泳（Immunoelectrophoresis)Immunoel
9、ectrophoresis)n n将待测血清标本作琼脂将待测血清标本作琼脂凝胶电泳，不同分子量凝胶电泳，不同分子量蛋白组分开，然后与电蛋白组分开，然后与电泳方向平行挖一泳方向平行挖一小槽小槽，加入加入相应的相应的抗血清抗血清，与，与不同区带的蛋白抗原作不同区带的蛋白抗原作双向免疫扩散，在各区双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成带相应的位置形成沉淀沉淀弧弧。n n常用于血清蛋白种类分常用于血清蛋白种类分析。析。第十六页，本课件共有45页火箭电泳火箭电泳（Rocket Electrophoresis)Rocket Electrophoresis)也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳也称免疫扩散，是
10、把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比峰的高度与抗原含量成正比。特点：需时较短，用于快速沉淀标本中抗特点：需时较短，用于快速沉淀标本中抗原含量的测定。原含量的测定。第十七页，本课件共有45页火箭电泳示意图火箭电泳示意图第十八页，本课件共有45页免疫标记技术免疫标记技术n n 用荧光素、同位素或酶等示踪物质用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标标记抗体（或抗原）
11、进行抗原记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。抗体反应。能极大地提高了反应的灵敏度，可以对能极大地提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。微量物质进行定量、定性或定位检测。n n三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。技术和同位素标记技术。第十九页，本课件共有45页免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术(Immunofluorescence Technique)Immunofluorescence Technique)n n 将荧光素（异硫氰酸荧光素，将荧光素（异硫氰酸荧光素，FITCFITC、藻红、藻红蛋白，蛋白，PE)PE)与抗
12、体连接成荧光抗体，再与与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，对标本察，抗原抗体复合物散发出荧光，对标本中抗原的鉴定和定位。中抗原的鉴定和定位。n n包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。第二十页，本课件共有45页n n直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。优点：是特异性强。缺点：标本染色。优点：是特异性强。缺点：每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。体。n n间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结间接荧
13、光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。优点：合，再用荧光素标记的二抗染色。优点：敏感性比直接法高，制备一种荧光素标敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测。记的二抗可用于多种抗原的检测。第二十一页，本课件共有45页n n补体结合免疫荧光法：在间接法的第一补体结合免疫荧光法：在间接法的第一步抗原步抗原-抗体反应时加入补体，使之与抗抗体反应时加入补体，使之与抗原原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗抗C3C3抗体进行示踪。抗体进行示踪。第二十二页，本课件共有45页间间接接免免疫疫荧荧光光法法示示意意图图第二十三页，本课件共有
14、45页免免疫疫荧荧光光显显微微技技术术第二十四页，本课件共有45页流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry,FCM)Flow Cytometry,FCM)FCMFCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。选收集。FCM FCM还可对同一细胞的多种参数（如还可对同一细胞的多种参数（如DNADNA、RNARNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析。蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析
15、。第二十五页，本课件共有45页流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理第二十六页，本课件共有45页酶免疫测定酶免疫测定(Enzyme Immunoassay,EIA)Enzyme Immunoassay,EIA)n n用酶（常用用酶（常用辣根过氧化物酶，即辣根过氧化物酶，即HRPHRP或或碱性碱性磷酸酶，即磷酸酶，即ALPALP)标记的抗体与相应抗原反标记的抗体与相应抗原反应。通过酶作用于底物后显色来判定结果。应。通过酶作用于底物后显色来判定结果。n n常用的方法有常用的方法有酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验和和酶免疫组酶免疫组化法化法，前者测定可溶性抗原或抗体，前者测定可溶性抗原或抗体，后者后者
16、测定组织中或细胞表面的抗原。测定组织中或细胞表面的抗原。第二十七页，本课件共有45页酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)ELISA)n n是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法等。心法、间接法等。第二十八页，
17、本课件共有45页 ELISAELISA 检测抗体检测抗体第二十九页，本课件共有45页第三十页，本课件共有45页放射免疫测定法放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA)Radioimmunoassay,RIA)n n用用放射性核素标记抗原放射性核素标记抗原进行的免疫学检进行的免疫学检测技术。放射性核素显示的高灵敏性，测技术。放射性核素显示的高灵敏性，使检测的敏感性达使检测的敏感性达pgpg水平。水平。n n常用于标记的放射性核素有常用于标记的放射性核素有I I125125和和I I131131。n n常用于胰岛素、生长激素、药物等微量常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。
18、物质的测定。第三十一页，本课件共有45页免疫印迹法（免疫印迹法（ImmunoblottingImmunoblotting）n n将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳电泳分区的蛋白质分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。疫、放射免疫等技术测定。n n能能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量量。常用于检测多种病毒（如。常用于检测多种病毒（如HIVHIV）的抗的抗体或抗原。体或抗原。第三十二页，本课件共有45页免免 疫疫 印印 迹迹 法法 示示 意意 图图第三十三页，本课件共有45
19、页第三节第三节 免疫细胞的检测免疫细胞的检测 n n检测检测各种淋巴细胞的数量与功能各种淋巴细胞的数量与功能是观察是观察机体免疫状态的重要手段。机体免疫状态的重要手段。n n外周血外周血是病人主要的检测标本，但仅代是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。表再循环的淋巴细胞。n n实验动物还可取实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结胸腺、脾、淋巴结等作等作为标本进行检查。为标本进行检查。第三十四页，本课件共有45页(1)(1)抗凝抗凝静脉血静脉血(2)(2)加等加等量量NSNS(4)(4)密度梯度离心密度梯度离心血浆血浆分离液分离液RBCPBMCPMN(3)(3)混匀后，缓慢混匀后，缓慢加于分离
20、液上加于分离液上第三十五页，本课件共有45页T T细胞功能测定细胞功能测定n n体外法：体外法：T T细胞增殖试验细胞增殖试验细胞增殖试验细胞增殖试验 形态学检查形态学检查 3 3H-TdRH-TdR掺入法掺入法 MTTMTT法法n n体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。OT-PPD OT-PPD皮试皮试皮试皮试 第三十六页，本课件共有45页培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验（淋巴细胞增殖试验（3 3H-TdRH-TdR掺入法）示
21、意图掺入法）示意图第三十七页，本课件共有45页靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时细胞毒试验（细胞毒试验（5151CrCr释放法）示意图：释放法）示意图：（NaNa5151CrOCrO4 4标记靶细胞）标记靶细胞）第三十八页，本课件共有45页细胞毒试验（乳酸脱氢酶释放法）细胞毒试验（乳酸脱氢酶释放法）正常情况下，乳酸脱氢酶（正常情况下，乳酸脱氢酶（LDHLDH）存在于）存在于细胞内，细胞损伤时，细胞膜通透性增加，细胞内，细胞损伤时，细胞膜通透性增加，LDHLDH释放，酶促显色反应。释放，酶促显色反应。第三十九页，本课件共有45页酶联免疫斑点法
22、酶联免疫斑点法（Enzyme-Linked Immunospot,ELISPOT)Enzyme-Linked Immunospot,ELISPOT)在在ELISAELISA的基础上建立的检测抗体生的基础上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。成细胞及细胞因子产生细胞的方法。第四十页，本课件共有45页CKCK抗体包被的反应板抗体包被的反应板抗体包被的反应板抗体包被的反应板 CKCK抗原包被的反应板抗原包被的反应板抗原包被的反应板抗原包被的反应板加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入酶标记二抗加入酶标记二抗加入酶标记二抗加入酶标记二抗加入底物加入底物加入底物加入底物检测抗原
23、特异性检测抗原特异性B B细胞细胞加入底物加入底物加入底物加入底物T T细胞产生细胞产生CKCK的检测的检测加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入酶标的加入酶标的加入酶标的加入酶标的CKCKCKCK抗体抗体抗体抗体第四十一页，本课件共有45页淋巴细胞转化试验（淋巴细胞转化试验（形态学示意图形态学示意图）n n原理：原理：T T T T细胞表面有细胞表面有PHAPHA或或ConAConA受体，受体，受体，受体，T T细胞在体外受细胞在体外受PHAPHA或或ConAConAConAConA的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，
24、以此测定且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定T T细胞的功能。细胞的功能。PHA刺激4872小时第四十二页，本课件共有45页淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖3 3H-TdRH-TdR掺入法掺入法n n原理：原理：将单个核细胞中加入将单个核细胞中加入PHAPHA共同培养，在共同培养，在终止培养前终止培养前8 8-15-15小时加入小时加入氚标记的胸腺嘧氚标记的胸腺嘧啶核苷（啶核苷（3 3H-TdR),H-TdR),经经-液体闪烁仪检测淋液体闪烁仪检测淋巴细胞巴细胞DNADNA的的3 3H-TdRH-TdR掺入量，推测淋巴细胞掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。增殖的程度。第四十三页，本课件共有45页MTT(MTT(四甲基偶氮唑盐）法四甲基偶氮唑盐）法n n原理：原理：在细胞培养终止前数小时加入在细胞培养终止前数小时加入MTTMTT，活活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解MTTMTT产生紫产生紫褐色甲攒（褐色甲攒（Formazan)Formazan)沉积于细胞内或细胞沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。关。第四十四页，本课件共有45页感感谢谢大大家家观观看看2/28/2023第四十五页，本课件共有45页