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1、关于免疫学检测技术的关于免疫学检测技术的基本原理及其应用基本原理及其应用第一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月提提 要要n n免疫学检测技术主要应用：免疫学检测技术主要应用：对多种免疫性疾病的诊断、疗效评估、对多种免疫性疾病的诊断、疗效评估、发病机制探讨发病机制探讨;对抗原性物质、免疫细胞、细胞因子、对抗原性物质、免疫细胞、细胞因子、粘附分子或细胞受体等的定性、定量检测。粘附分子或细胞受体等的定性、定量检测。第二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月第一节第一节 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测n n 抗原抗原-抗体反应包括：抗体反应包括：沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体沉淀反应
2、、凝集反应、溶解反应、补体结合反应、中和反应等。结合反应、中和反应等。n n 抗原抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测未抗体反应可用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。第三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月第一节第一节 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测n n免疫标记技术包括：免疫标记技术包括：免疫酶技术、免疫荧光技术、同位素标免疫酶技术、免疫荧光技术、同位素标记技术、化学发光免疫技术、免疫胶体金技记技术、化学发光免疫技术、免疫胶体金技术等。术等。第四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月抗原抗原-抗体反应的特点
3、：抗体反应的特点：P226P226抗原抗原抗原抗原-抗体的特异性结合。抗体的特异性结合。抗体的特异性结合。抗体的特异性结合。抗原抗体分子表面的非共价键结合。抗原抗体分子表面的非共价键结合。反应的两个阶段：反应的两个阶段：反应的两个阶段：反应的两个阶段：特异性结合阶段；特异性结合阶段；可见的反应阶段。可见的反应阶段。是否呈现可见的反应现象，与抗原和抗体两者的是否呈现可见的反应现象，与抗原和抗体两者的是否呈现可见的反应现象，与抗原和抗体两者的是否呈现可见的反应现象，与抗原和抗体两者的分子浓度和比例密切相关。分子浓度和比例密切相关。分子浓度和比例密切相关。分子浓度和比例密切相关。第五张，PPT共四十
4、五页，创作于2022年6月抗原抗体比例对反应现象的影响抗原抗体比例对反应现象的影响第六张，PPT共四十五页，创作于2022年6月抗原抗原-抗体反应的影响因素抗体反应的影响因素n n1 1.电解质电解质：抗原抗原-抗体反应通常应用抗体反应通常应用0.85%0.85%的氯化钠（适当浓度的电解质）作为稀释的氯化钠（适当浓度的电解质）作为稀释液。液。n n2 2.温度温度：反应常在反应常在3737水浴或孵育箱中进水浴或孵育箱中进行。行。n n3.3.酸碱度酸碱度：抗原抗原-抗体反应适应的酸碱度抗体反应适应的酸碱度 为为PH6-8PH6-8。第七张，PPT共四十五页，创作于2022年6月抗原抗体的检测方
5、法抗原抗体的检测方法n n凝集反应凝集反应n n沉淀反应沉淀反应n n中和反应中和反应n n用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应第八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月凝集反应凝集反应(Agglutination)Agglutination)n n 细菌、红细胞等细菌、红细胞等颗粒性抗原颗粒性抗原与相应抗体结合、与相应抗体结合、凝集的现象。凝集的现象。n n1 1、直接凝集：、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法（定性试验）和试管法（半定又
6、分为玻片法（定性试验）和试管法（半定量试验）。量试验）。第九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月凝集反应凝集反应(Agglutination)Agglutination)n n2 2、间接凝集：、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，形成乳胶颗粒表面，形成致敏颗粒致敏颗粒，与相应抗体，与相应抗体反应出现的颗粒凝集现象。反应出现的颗粒凝集现象。第十张，PPT共四十五页，创作于2022年6月血血 球球 凝凝 集集第十一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月沉淀反应沉淀反应（Precipitation)Precipitation)血清蛋白质、细胞裂解液
7、或组织浸液血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等等可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀与相应抗体结合后出现沉淀物，称为沉淀反应。物，称为沉淀反应。第十二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月沉淀反应沉淀反应（Precipitation)Precipitation)沉淀反应可在沉淀反应可在液体液体中进行，如絮状沉中进行，如絮状沉淀。淀。大多数沉淀反应是用大多数沉淀反应是用半固体琼脂凝胶半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。第十三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月单向免疫扩散单向免疫扩散(Single Immunodiffusion)
8、Single Immunodiffusion)n n将一定量将一定量将一定量将一定量已知抗体混于琼已知抗体混于琼已知抗体混于琼已知抗体混于琼脂凝胶中脂凝胶中脂凝胶中脂凝胶中制琼脂板；打孔，制琼脂板；打孔，制琼脂板；打孔，制琼脂板；打孔，将将将将抗原加入孔中扩散抗原加入孔中扩散抗原加入孔中扩散抗原加入孔中扩散。n n抗原与抗体相遇，形成抗原与抗体相遇，形成抗原与抗体相遇，形成抗原与抗体相遇，形成沉沉沉沉淀环淀环淀环淀环，环的直径与抗原含，环的直径与抗原含，环的直径与抗原含，环的直径与抗原含量成正比。量成正比。量成正比。量成正比。n n常用于测定血清常用于测定血清常用于测定血清常用于测定血清IgG
9、IgGIgGIgG、IgMIgMIgMIgM、IgA IgA IgA IgA 和和和和 C C C C 3 3 3 3等的含量。等的含量。等的含量。等的含量。含抗体的凝胶含抗体的凝胶沉淀环沉淀环第十四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月双向免疫扩散双向免疫扩散 （Double Immunodiffusion)Double Immunodiffusion)n n将抗原与抗体分别加入琼将抗原与抗体分别加入琼将抗原与抗体分别加入琼将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自脂凝胶的小孔中，二者自脂凝胶的小孔中，二者自脂凝胶的小孔中，二者自由扩散并相遇，在比例合由扩散并相遇，在比例合由扩散并相遇
10、，在比例合由扩散并相遇，在比例合适处形成适处形成适处形成适处形成沉淀线沉淀线沉淀线沉淀线。n n含两种以上的抗原抗体系含两种以上的抗原抗体系含两种以上的抗原抗体系含两种以上的抗原抗体系统，可出现两条以上的沉统，可出现两条以上的沉统，可出现两条以上的沉统，可出现两条以上的沉淀线。淀线。淀线。淀线。n n常用于抗原或抗体的定性常用于抗原或抗体的定性常用于抗原或抗体的定性常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性、组成和两种抗原相关性、组成和两种抗原相关性、组成和两种抗原相关性分析的检测。分析的检测。分析的检测。分析的检测。第十五张，PPT共四十五页，创作于2022年6月免疫电泳免疫电泳（Imm
11、unoelectrophoresis)Immunoelectrophoresis)n n将待测血清标本作琼脂将待测血清标本作琼脂将待测血清标本作琼脂将待测血清标本作琼脂凝胶电泳，不同分子量凝胶电泳，不同分子量凝胶电泳，不同分子量凝胶电泳，不同分子量蛋白组分开，然后与电蛋白组分开，然后与电蛋白组分开，然后与电蛋白组分开，然后与电泳方向平行挖一泳方向平行挖一泳方向平行挖一泳方向平行挖一小槽小槽小槽小槽，加入加入加入加入相应的相应的相应的相应的抗血清抗血清抗血清抗血清，与，与，与，与不同区带的蛋白抗原作不同区带的蛋白抗原作不同区带的蛋白抗原作不同区带的蛋白抗原作双向免疫扩散，在各区双向免疫扩散，在各
12、区双向免疫扩散，在各区双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成带相应的位置形成带相应的位置形成带相应的位置形成沉淀沉淀沉淀沉淀弧弧弧弧。n n常用于血清蛋白种类分常用于血清蛋白种类分常用于血清蛋白种类分常用于血清蛋白种类分析。析。析。析。第十六张，PPT共四十五页，创作于2022年6月火箭电泳火箭电泳（Rocket Electrophoresis)Rocket Electrophoresis)也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成，两者
13、比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比度与抗原含量成正比。特点：需时较短，用于快速沉淀标本中抗特点：需时较短，用于快速沉淀标本中抗原含量的测定。原含量的测定。第十七张，PPT共四十五页，创作于2022年6月火箭电泳示意图火箭电泳示意图第十八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月免疫标记技术免疫标记技术n n 用荧光素、同位素或酶等示踪物质用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记标记抗体（或抗原）进行抗原抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。能抗体反应。能极大地提高了反应的灵敏度，可以对微量极大地提高了反应的
14、灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。物质进行定量、定性或定位检测。n n三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。术和同位素标记技术。第十九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术(Immunofluorescence Technique)Immunofluorescence Technique)n n 将荧光素（异硫氰酸荧光素，将荧光素（异硫氰酸荧光素，FITCFITC、藻红、藻红蛋白，蛋白，PE)PE)与抗体连接成荧光抗体，再与待与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，
15、测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，对标本中抗原抗原抗体复合物散发出荧光，对标本中抗原的鉴定和定位。的鉴定和定位。n n包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。第二十张，PPT共四十五页，创作于2022年6月n n直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。优点：是特异性强。缺点：每检本染色。优点：是特异性强。缺点：每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。n n间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。优点：
16、敏感再用荧光素标记的二抗染色。优点：敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测。抗可用于多种抗原的检测。第二十一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月n n补体结合免疫荧光法：在间接法的第一步补体结合免疫荧光法：在间接法的第一步抗原抗原-抗体反应时加入补体，使之与抗原抗体反应时加入补体，使之与抗原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗C3C3抗体进行示踪。抗体进行示踪。第二十二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月间间接接免免疫疫荧荧光光法法示示意意图图第二十三张，PPT共四十五页，创作于2022年
17、6月免免疫疫荧荧光光显显微微技技术术第二十四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry,FCM)Flow Cytometry,FCM)FCMFCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。选收集。FCM FCM FCM FCM还可对同一细胞的多种参数（如还可对同一细胞的多种参数（如DNADNA、RNARNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析
18、。蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析。蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析。蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析。第二十五张，PPT共四十五页，创作于2022年6月流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理第二十六张，PPT共四十五页，创作于2022年6月酶免疫测定酶免疫测定(Enzyme Immunoassay,EIA)Enzyme Immunoassay,EIA)n n用酶（常用用酶（常用辣根过氧化物酶，即辣根过氧化物酶，即HRPHRP或或碱性磷碱性磷酸酶，即酸酶，即ALPALP)标记的抗体与相应抗原反应。标记的抗体与相应抗原反应。通过酶作用于底物后显色来判定结果。通过酶作用于底物后显色来判定结果。
19、n n常用的方法有常用的方法有酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验和和酶免疫组酶免疫组化法化法，前者测定可溶性抗原或抗体，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测后者测定组织中或细胞表面的抗原。定组织中或细胞表面的抗原。第二十七张，PPT共四十五页，创作于2022年6月酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)Assay,ELISA)n n是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体
20、反应在固相表面进行。用洗涤法将液相体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法等。间接法等。第二十八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月 ELISAELISA 检测抗体检测抗体第二十九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月第三十张，PPT共四十五页，创作于2022年6月放射免疫测定法放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA)Radioimmunoassay,RIA)n n用用放射性核素标记抗原放射性核素标记抗原进行的免疫学检测进行的免疫学检测技术。放射性核素显示的高灵敏性，使检技术。放射性核素显示的
21、高灵敏性，使检测的敏感性达测的敏感性达pgpg水平。水平。n n常用于标记的放射性核素有常用于标记的放射性核素有I I125125和和I I131131。n n常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。质的测定。第三十一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月免疫印迹法（免疫印迹法（ImmunoblottingImmunoblotting）n n将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳电泳分区的蛋白质分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。放射免疫等技术测定。n n能能分离
22、分子大小不同的蛋白质并确定其分子分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量量。常用于检测多种病毒（如。常用于检测多种病毒（如HIVHIV）的抗体的抗体或抗原。或抗原。第三十二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月免免 疫疫 印印 迹迹 法法 示示 意意 图图第三十三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月第三节第三节 免疫细胞的检测免疫细胞的检测 n n检测检测各种淋巴细胞的数量与功能各种淋巴细胞的数量与功能是观察机是观察机体免疫状态的重要手段。体免疫状态的重要手段。n n外周血外周血是病人主要的检测标本，但仅代表是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。再循环的淋巴细胞。n n实验动
23、物还可取实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结胸腺、脾、淋巴结等作为等作为标本进行检查。标本进行检查。第三十四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月(1)(1)抗凝抗凝静脉血静脉血(2)(2)加等加等量量NSNS(4)(4)密度梯度离心密度梯度离心血浆血浆分离液分离液RBCPBMCPMN(3)(3)混匀后，缓慢混匀后，缓慢加于分离液上加于分离液上第三十五张，PPT共四十五页，创作于2022年6月T T细胞功能测定细胞功能测定n n体外法：体外法：体外法：体外法：T T T T细胞增殖试验细胞增殖试验细胞增殖试验细胞增殖试验 形态学检查形态学检查形态学检查形态学检查 3 3 3 3H-TdRH-Td
24、RH-TdRH-TdR掺入法掺入法掺入法掺入法 MTTMTTMTTMTT法法法法n n体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。OT-PPD OT-PPD OT-PPD OT-PPD皮试皮试皮试皮试 第三十六张，PPT共四十五页，创作于2022年6月培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验（淋巴细胞增殖试验（3 3H-TdRH-TdR掺入法）示意图掺入法）示意图第三十七张，PPT共四十五页，创作于2022年6月靶细胞51Cr洗涤去除游离的51
25、Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时细胞毒试验（细胞毒试验（5151CrCr释放法）示意图：释放法）示意图：（NaNa5151CrOCrO4 4标记靶细胞）标记靶细胞）第三十八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月细胞毒试验（乳酸脱氢酶释放法）细胞毒试验（乳酸脱氢酶释放法）正常情况下，乳酸脱氢酶（正常情况下，乳酸脱氢酶（LDHLDH）存在于细胞）存在于细胞内，细胞损伤时，细胞膜通透性增加，内，细胞损伤时，细胞膜通透性增加，LDHLDH释放，酶释放，酶促显色反应。促显色反应。第三十九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-Li
26、nked Immunospot,ELISPOT)Enzyme-Linked Immunospot,ELISPOT)在在ELISAELISA的基础上建立的检测抗体生的基础上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。成细胞及细胞因子产生细胞的方法。第四十张，PPT共四十五页，创作于2022年6月CKCK抗体包被的反应板抗体包被的反应板抗体包被的反应板抗体包被的反应板 CKCK抗原包被的反应板抗原包被的反应板抗原包被的反应板抗原包被的反应板加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入酶标记二抗加入酶标记二抗加入酶标记二抗加入酶标记二抗加入底物加入底物加入底物加入底物检测抗原特异性检测抗
27、原特异性B B B B细胞细胞细胞细胞加入底物加入底物加入底物加入底物T T细胞产生细胞产生CKCK的检测的检测加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入淋巴细胞加入酶标的加入酶标的加入酶标的加入酶标的CKCKCKCK抗体抗体抗体抗体第四十一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月淋巴细胞转化试验（淋巴细胞转化试验（形态学示意图形态学示意图）n n原理：原理：原理：原理：T T T T细胞表面有细胞表面有细胞表面有细胞表面有PHAPHAPHAPHA或或或或ConAConAConAConA受体，受体，受体，受体，T T T T细胞在体外受细胞在体外受细胞在体外受细胞在体外受PHAPHAPHAPH
28、A或或或或ConAConAConAConA的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定行分裂的淋巴细胞，以此测定行分裂的淋巴细胞，以此测定行分裂的淋巴细胞，以此测定T T T T细胞的功能。细胞的功能。细胞的功能。细胞的功能。PHA刺激4872小时第四十二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖3 3H-TdRH-TdR掺入法掺入法n n原理：原理：将单个核细胞中加入将单个核细胞中加入PHAPHA共同培养，在共同培养，在
29、终止培养前终止培养前8 8-15-15小时加入小时加入氚标记的胸腺嘧啶氚标记的胸腺嘧啶核苷（核苷（3 3H-TdR),H-TdR),经经-液体闪烁仪检测淋巴液体闪烁仪检测淋巴细胞细胞DNADNA的的3 3H-TdRH-TdR掺入量，推测淋巴细胞增殖掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。的程度。第四十三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月MTT(MTT(四甲基偶氮唑盐）法四甲基偶氮唑盐）法n n原理：原理：在细胞培养终止前数小时加入在细胞培养终止前数小时加入MTTMTT，活细活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解MTTMTT产生紫褐色产生紫褐色甲攒（甲攒（Formazan)Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。第四十四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月感感谢谢大大家家观观看看第四十五张，PPT共四十五页，创作于2022年6月9/17/2022