《免疫学检测技术的基本原理精选课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫学检测技术的基本原理精选课件.ppt（34页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、关于免疫学检测技术的基本原理第一页，本课件共有34页第一节第一节 体外免疫反应的特点及影响因素体外免疫反应的特点及影响因素(一一)抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点1.高度特异性高度特异性 特异性越强，亲和力也越高；特异性越强，亲和力也越高；2.表面化学基团之间的可逆结合表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间结抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键构互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等非共价结合。不如共价键稳定，易受温度、酸碱度和等非共价结合。不如共价键稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特离子强度的影响
2、而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性；性；3.适宜的抗原抗体浓度和比例适宜的抗原抗体浓度和比例 决定抗原抗体结合后能否出决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应；现肉眼可见的反应；4.抗原抗体反应的抗原抗体反应的2个阶段个阶段 第第1阶段是抗原抗体特异性结合，阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完成；第可在数秒钟至几分钟内完成；第2阶段是小的抗原抗体复合阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间从数分钟至物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。数日不等。第二页，本课件共有34页(二二)抗原抗体反应的影响因素抗原抗体反应的影响因素1.电解质电解质
3、 抗原抗体等电点分别为抗原抗体等电点分别为pH3-5和和pH5-6，在中性，在中性或弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质或弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而相互结合；会使它们失去一部分负电荷而相互结合；2.温度温度 通常为通常为37，适当提高反应温度可增加抗原与抗体分，适当提高反应温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，但子的碰撞机会，但56以上可使抗原或抗体变性失活；以上可使抗原或抗体变性失活；3.酸碱度酸碱度 抗原抗体反应的最适抗原抗体反应的最适pH值在值在6-8之间，之间，pH值过高或值过高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当过低均可直
4、接影响抗原抗体的理化性质。当pH值接近等电点值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。致非特异性反应。第三页，本课件共有34页第二节第二节 检测抗原和抗体的体外实验检测抗原和抗体的体外实验第四页，本课件共有34页AbAg高亲和力AbAg低亲和力特异性特异性结合力的表示方法结合力的表示方法亲和力和亲合力亲和力和亲合力低亲合力高亲合力Ag-Ab反应的原理反应的原理第五页，本课件共有34页Ab 过剩Ag 过剩比例适当，交联成网络Ag-Ab反应的可见性反应的可见性第六页，本课件共有34页1.1.凝集反应凝
5、集反应直接凝集反应 1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16 细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。玻片法试管法常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定常用于检测抗体的滴度或效价，见于临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验。第七页，本课件共有34页间接凝集反应间接凝集反应将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。凝集反应常用于溶血性疾病的诊
6、断：+病人的病人的RBC体内体内anti-Rh由于抗体多属于由于抗体多属于IgG，分子量较，分子量较小，抗体与红细胞间的结合力不小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现能克服细胞间的排斥力，不出现凝集凝集+体外加入抗体外加入抗人人IgG出现凝集现象，叫出现凝集现象，叫直接库姆试验直接库姆试验正常人正常人O型血的型血的Rh+的的RBC+患者血清内的患者血清内的游离游离anti-Rh+体外加入抗体外加入抗人人IgG出现凝集现象，出现凝集现象，叫叫间接库姆试验间接库姆试验第八页，本课件共有34页2.沉淀反应沉淀反应AgAgAgAgAb in gel单向免疫扩散单向免疫扩散Ag1AbA
7、g2Ag3Ag4双向免疫扩散双向免疫扩散免疫比浊免疫比浊过量Ab Ab Ab Ab毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。鉴定多种抗原是完全相同、鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同部分相同或完全不同用于确定用于确定抗原浓度抗原浓度第九页，本课件共有34页沉淀反应沉淀反应免疫电泳免疫电泳存在于不同区域的抗原与抗体存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀结合，在比例适宜处形成沉淀弧。沉淀弧的数量、位置和形弧。沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样状与标准品相对比，
8、可分析样品的成分及其性质。品的成分及其性质。第十页，本课件共有34页3.3.免疫标记技术免疫标记技术免疫酶测定法免疫酶测定法免疫荧光技术免疫荧光技术放射免疫测定法放射免疫测定法免疫胶体金技术免疫胶体金技术第十一页，本课件共有34页免疫酶测定法免疫酶测定法a)夹心法夹心法ELISAb)间接间接ELISAc)BASELISA 利用生物利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁素和抗生物素蛋白为桥梁d)微粒捕获酶免疫分析技术微粒捕获酶免疫分析技术 将已知特异性抗体致敏的免疫将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素、亲和素、酶相微粒与生物素、亲和素、酶相结合，最后酶作用于荧光底物结合，最后酶作用于荧光底物发光，通过
9、检测荧光强度判断发光，通过检测荧光强度判断未知抗原的含量。未知抗原的含量。a）b）第十二页，本课件共有34页e)免疫组化技术免疫组化技术定位、定性、定量检测第十三页，本课件共有34页免疫荧光技术免疫荧光技术第十四页，本课件共有34页放射免疫测定放射免疫测定用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。化学发光免疫技术化学发光免疫技术将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。灵敏度高、简便、可实现自动化分析。第十五
10、页，本课件共有34页免疫胶体金技术免疫胶体金技术1.用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。2.氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。3.该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。第十六页，本课件共有34页免疫印迹法免疫印迹法-Western blotting第十七页，本课件共有34页4.4.蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术又称为蛋白质微列阵，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微列阵。根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。第十八页，本课件共有34页第三节第三节 免疫细胞功能的
11、检测免疫细胞功能的检测淋巴细胞及其淋巴细胞及其亚群的分离亚群的分离免疫细胞免疫细胞功能测定功能测定磁珠分离磁珠分离法法免疫吸附免疫吸附分离法分离法流式细胞流式细胞术术肽肽MHC四聚四聚体技术体技术T细胞功能细胞功能测定测定B细胞功能细胞功能测定测定细胞因子细胞因子检测检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒试细胞毒试验验吞噬功能吞噬功能测定测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法第十九页，本课件共有34页外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离稀释血液淋巴细胞分离液(葡聚糖-泛影葡胺r=
12、1.078)离心单 个核细胞(PBMC，包括淋巴细胞、DC和NK)红细胞和粒细胞血浆第二十页，本课件共有34页磁珠分离法磁珠分离法免疫吸附分离法免疫吸附分离法流式细胞术流式细胞术肽肽MHC四聚体技术四聚体技术淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离第二十一页，本课件共有34页免疫吸附分离法免疫吸附分离法加入淋巴细胞悬液anti-CD4anti-CD4anti-CD4弃上清第二十二页，本课件共有34页磁珠分离法磁珠分离法第二十三页，本课件共有34页流式细胞术流式细胞术荧光抗体标记混合细胞喷嘴单细胞悬液5000-10000个/秒细胞分选器荧光检测器第二十四页，本课件共有34页抗原肽抗原肽-MH
13、C四聚体分离技术四聚体分离技术亲和素亲和素抗原肽抗原肽MHC I生物素生物素anti-CD8肽-四聚体肽特异性CD8TCD4T及B非肽特异性CD8T荧光素荧光素第二十五页，本课件共有34页二、免疫细胞功能的测定二、免疫细胞功能的测定T细胞功细胞功能测定能测定B细胞功能细胞功能测定测定细胞因细胞因子检测子检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒试细胞毒试验验吞噬功能吞噬功能测定测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法第二十六页，本课件共有34页T细胞功能细胞功能测定测定T细胞增殖试验迟发型超敏
14、反应的检测T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测：1.形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁；2.3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。3.MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法：外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏
15、死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染。第二十七页，本课件共有34页B细胞功细胞功能测定能测定抗体含量测定溶血空斑试验可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。绵羊红细胞(SRB C)免疫动物4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中混匀在抗体形成细胞周围出现溶解的透明区，即溶血空斑。1个空斑区代表1个浆细胞通过记录溶血空斑的数目可知抗原特异性B细胞的数目加入新鲜补体，倒入平皿中培养第二十八页，本课件共有34页细胞毒细胞毒试验试验51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色
16、法靶细胞被杀伤后，向体系中加入台盼兰，可进入膜破损的细胞内，将细胞染成蓝色。活细胞拒染而不着色。第二十九页，本课件共有34页凋亡细胞检测法琼脂糖电泳法正常细胞基因组DNA凋亡细胞TUNEL法在细胞中加入末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和生物素标记的核苷酸TdT能在游离的DNA3端缺口连接标记的核苷酸加入亲和素-酶复合物，在DNA断裂处显色流式细胞术Annexin VPI凋亡早期凋亡晚期坏死期第三十页，本课件共有34页巨噬细胞吞噬试验吞噬功吞噬功能测定能测定硝基蓝四氮唑(NBT)试验NBT在杀菌过程中产生反应性氧中间物，其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆
17、中。光镜下计数NBT阳性细胞可反映PMN的杀伤功能。将待测mf与鸡红细胞混合温育后，鸡红细胞被mf吞噬，根据吞噬百分率确定mf吞噬能力。吞噬百分率=吞有红细胞的mf/mf总数第三十一页，本课件共有34页细胞因子细胞因子检测检测生物活性检测法免疫学检测法夹心ELISA或ELISPOT荧光素标记抗体染胞内细胞因子，FACS分析细胞增殖或增殖抑制法，如细胞因子依赖性或抑制性细胞株细胞病变抑制法，如感干扰素抑制病毒感染性细胞损伤第三十二页，本课件共有34页检测B细胞产生的抗体检测T细胞产生的CK酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验-ELISpot 第三十三页，本课件共有34页感谢大家观看2022/12/10第三十四页，本课件共有34页