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1、第二十二章第二十二章 免疫学检测技术的基本原理免疫学检测技术的基本原理p229一一.体外抗原抗体反应的特征体外抗原抗体反应的特征 1.1.高度特异性高度特异性 抗原的表位与抗体的抗原结合点结构互补。抗原的表位与抗体的抗原结合点结构互补。2.2.可见性可见性 抗原与相应抗体结合后能抗原与相应抗体结合后能肉眼直接观察。肉眼直接观察。二二.抗原抗体反应的影响因素抗原抗体反应的影响因素 1.1.温温 度：最适温度为度：最适温度为37。2.2.酸碱度：最适酸碱度：最适p pH=6-8。3.3.电解质：可促进抗原与抗体的结合。电解质：可促进抗原与抗体的结合。常用生理盐水。常用生理盐水。抗原抗体比例对反应现
2、象的影响抗原抗体比例对反应现象的影响三三.检测抗原和抗体的体外试验检测抗原和抗体的体外试验（一）凝集反应（一）凝集反应 颗粒性抗原颗粒性抗原（RBCRBC、细菌等）与相应抗体、细菌等）与相应抗体 结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。1 1直接凝集试验直接凝集试验（1 1）玻片凝集试验：用于）玻片凝集试验：用于定性测抗原定性测抗原。如如ABOABO血型鉴定，细菌的鉴定、分型等。血型鉴定，细菌的鉴定、分型等。（2 2）试管凝集试验：用于）试管凝集试验：用于定量测抗体定量测抗体 如肥达氏反应。如肥达氏反应。2 2间接凝集试验间接凝集试验 如类风湿因子的测定等。如类
3、风湿因子的测定等。（二）二）沉淀反应沉淀反应 可溶性抗原可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与（血清蛋白、组织浸液等）与 相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故 又称为又称为琼脂扩散试验或免疫扩散琼脂扩散试验或免疫扩散。1单向免疫扩散单向免疫扩散 用于用于定量测抗原定量测抗原。如检测血清免疫球蛋白、如检测血清免疫球蛋白、C3等含量等含量。2双向免疫扩散双向免疫扩散 主要用于主要用于定性检测抗原或抗体定性检测抗原或抗体，抗原组成及两抗原组成及两 种抗原相关性种抗原相关性分析。分析。3 3免
4、疫电泳免疫电泳 其方法是其方法是先电泳、后扩散。主要用于先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析抗原成分的分析，亦可，亦可用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断。用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断。4免疫比浊免疫比浊 用于用于定量测抗原定量测抗原。该法快速、简便。该法快速、简便。5）免疫比浊法）免疫比浊法 在一定量定量的抗体中分别加入递增量递增量的抗原，经一定时间后形成免疫复合物。用浊度计浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多，复合物形成越多，浊度越高浊度越高，绘制标准曲线并根据反应液体的浊度，推算样品中的抗原含量。（三）免疫标记技术（三）免疫标记技术 用荧光素、同位素或酶
5、等示踪物质用荧光素、同位素或酶等示踪物质用荧光素、同位素或酶等示踪物质用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体标记抗体标记抗体标记抗体（或抗原）进行抗原（或抗原）进行抗原（或抗原）进行抗原（或抗原）进行抗原-抗体反应。抗体反应。抗体反应。抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变 抗体（或抗原）的免疫学特性，且极大的提高了抗体（或抗原）的免疫学特性，且极大的提高了抗体（或抗原）的免疫学特性，且极大的提高了抗体（或抗原）的免疫学特性，且极大的提高了 反应的灵敏度，可以对
6、微量物质进行定量、定性反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性 或定位检测。或定位检测。或定位检测。或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术 免疫酶技术免疫酶技术免疫酶技术免疫酶技术 同位素标记同位素标记同位素标记同位素标记技术技术技术技术 1免疫荧光技术免疫荧光技术(Immunofluorescence Technique)Immunofluorescence
7、Technique)用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。（1）常用荧光素）常用荧光素 异硫氰酸荧光素（异硫氰
8、酸荧光素（FITC），），显黄绿色。显黄绿色。藻红蛋白（藻红蛋白（PE），显红色。），显红色。（2）方法）方法 *直接荧光法：直接荧光法：优点优点优点优点-特异性强特异性强特异性强特异性强 缺点缺点缺点缺点-每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。*间接荧光法间接荧光法 优点优点优点优点-敏感性比直接法高，且制备一种荧光素标记的二抗可敏感性比直接法高，且制备一种荧光素标记的二抗可敏感性比直接法高，且制备一种荧光素标记的二抗可敏感性比直接法高，且制备一种荧光素标记的二抗可 用于多种抗原
9、的检测，用于多种抗原的检测，用于多种抗原的检测，用于多种抗原的检测，缺点缺点缺点缺点-非特异性荧光增加。非特异性荧光增加。非特异性荧光增加。非特异性荧光增加。2 2酶免疫测定（酶免疫测定（Enzyme Immunoassay,EIAEIA）用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。其检测的敏感度可达其检测的敏感度可达pg-ng/mlpg-ng/ml水平。水平。Ab +E AbAb +E AbE E
10、 Ag +AbAg +AbE E AgAbAgAbE E +底物底物 呈色反应呈色反应EIA（1）标记的酶标记的酶：辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（）、碱性磷酸酶（AP）。）。（2）常用方法）常用方法:A 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）将已知的抗原
11、或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除成分洗除成分洗除成分洗除.用于可溶性抗原和抗体的检测。用于可溶性抗原和抗体的检测。用于可溶性抗原和抗体的检测。用于可溶性抗原和抗体的检测。*间接法：用于检测抗体间接法：用于检测抗体 *双抗体夹心法：用于检测抗原。双抗体夹心法：用于检测抗原。B 免疫组化技术免疫组化技术检测组织中或细胞表面的抗原。检测组织中或细胞表面的抗原。对
12、抗原进行定性、定量、定位检测。对抗原进行定性、定量、定位检测。C 酶联免疫斑点试验（酶联免疫斑点试验（ELISPOT）可用于细胞因子的检测可用于细胞因子的检测3 3放射免疫测定法（放射免疫测定法（RIARIA）敏感度可达敏感度可达pgpg水平，水平，其标记物为其标记物为125125I I、131131I I等。等。常用于常用于微量物质的检测微量物质的检测，如激素、，如激素、IgEIgE等。等。4 4化学发光免疫分析化学发光免疫分析 该法是将发光物吖啶酯、或鲁米诺标记抗原或抗体进该法是将发光物吖啶酯、或鲁米诺标记抗原或抗体进行的结合反应。行的结合反应。发光物质在反应剂激发下生成激发态中间体，当激
13、发发光物质在反应剂激发下生成激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时发射出态中间体回到稳定的基态时发射出光子光子，用自动，用自动发光分析发光分析仪仪能接收光信号，测定光子的产量，以反映待检样品中抗能接收光信号，测定光子的产量，以反映待检样品中抗体或抗原的含量体或抗原的含量。其灵敏度高于其灵敏度高于RIARIA，常用于，常用于超微量物质超微量物质的测定的测定，如甲状腺素等。如甲状腺素等。5 5免疫印迹法（免疫印迹法（Western blottingWestern blotting）该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫技术测定。免疫技术测定。常用于检测多种病毒的抗原或抗体。如检测常用于检测多种病毒的抗原或抗体。如检测HIVHIV抗体。抗体。免免 疫疫 印印 迹迹 法法 示示 意意 图图HIV的免疫印记的免疫印记免疫胶体金技术