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1、重组DNA技术与基因工程5 2 3 4 1 6 重组重组DNADNA技术与基因工程的基本概念技术与基因工程的基本概念重组重组DNADNA技术所需的基本条件技术所需的基本条件重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达A A 用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶2 2 重组重组DNADNA技术所需的基本条件技术所需的基本条件限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶核酸酶核酸酶核酸修饰酶核酸修饰酶
2、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链识别双链DNADNA分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割DNADNA双链双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNADNA的入侵的入侵细菌的限制与修饰作用细菌的限制与修饰作用hsd hsd R R：编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶hsd hsd MM：编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶hsd hsd S S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达编码限制性酶和甲基化酶的协同表达19681968年，年，SmithSmith等人首先从
3、等人首先从流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出 Hind IIHind II和和Hind IIIHind III 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型主要特性主要特性 I I 型型 II II 型型 III III 型型限制修饰限制修饰多功能多功能单功能单功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子ATP MgATP Mg2+2+SAM SAMATP MgATP Mg2+2+SAM SAMMgMg2+2+识别序列识别序列TGANTGAN88TGCTTGCT旋转对称序列旋转对称序
4、列GAGCCGAGCCAACNAACN66GTGCGTGCCAGCAGCAGCAG切割位点切割位点距识别序列距识别序列1 1kbkb处处识别序列内或附近识别序列内或附近距识别序列下游距识别序列下游随机性切割随机性切割特异性切割特异性切割24-2624-26bpbp处处限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名属名属名 种名种名 株名株名H i n d IIIH i n d III H i nH i n d III d IIIH Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae d d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d d株株同一
5、菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链识别双链DNADNA分子中分子中4-84-8对碱基的特定序列对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构5 5 G C T G C T G A A T T CG A A T T C G A G 3 G A G 33 3 C G A C G A C T T A A GC T T A A G
6、 C T C 5 C T C 5EcoR I EcoR I 的识别序列的识别序列EcoR I EcoR I 的切割位点的切割位点EcoRI EcoRI 等产生的等产生的 5 5 粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-T T-GG-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-GG-CC-T T-C 5C 5EcoRI 37 EcoRI 37 5 5 GG-CC-T T-GG-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-PP OHOH-G
7、G-CC-T T-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-CC-T T-GG AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA GG-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPPPstI PstI 等产生的等产生的 3 3 粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5PstI 37 PstI 37 5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA
8、-OHOH PP-G-G-A-G-G-G-A-G 3 33 3 CC-GG-AA-GG-PP OHOH-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPPPvuIIPvuII等产生的平头末端等产生的平头末端5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC
9、-CC-T T-C 5C 5PvuII 37 PvuII 37 5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-OHOH PP-CC-T T-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-PP OHOH-GG-AA-CC-CC-T T-C 5 C 5 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分大部分II II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HClTris-HCl50 mM pH 7.550 mM pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMNa
10、ClNaCl0-150 mM0-150 mMDTTDTT1 mM1 mM0-50 mM 0-50 mM 低盐酶低盐酶100 mM 100 mM 中盐酶中盐酶150 mM 150 mM 高盐酶高盐酶VolumeVolume20-100 20-100 m ml lT TT T37 37 1-1.5 1-1.5 hrhr1 1 U U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 1 小时，完全小时，完全水解水解 1 1 m mg g 标准标准DNADNA所需的酶量所需的酶量限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核
11、酸内切酶酶解反应的操作II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5 5 GCTACATGCTACATGGATCCCGGGGGATCCCGGGTTCGCAT3TTCGCAT33 3 CGATGTACGATGTACCTAGGGCCCCCTAGGGCCCAAGCGTA5AAGCGTA5BamHI SmaIBamHI SmaI5 5 GCTACATGCTACATG GATCCCGGGG GATCCCGGGTTCGCAT3 TTCGCAT3 3 3 CGATGTACGATGT
12、ACCTAG GGCCCCCTAG GGCCCAAGCGTA5AAGCGTA55 5 GCTACATGCTACATGGATCCC GGGGGATCCC GGGTTCGCAT3TTCGCAT33 3 CGATGTACGATGTACCTAGGG CCCCCTAGGG CCCAAGCGTA5AAGCGTA5限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶
13、解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.10.1倍体积的倍体积的 5 5 M NaAc pH 5.4M NaAc pH 5.42.52.5倍体积的冰冷乙醇倍体积的冰冷乙醇冰浴冰浴 5 5 分钟、高速冷冻离心分钟、高速冷冻离心1010分钟、干燥分钟、干燥限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素DNADNA样品的纯度：样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDT
14、AEDTA、SDSSDS、NaClNaCl等等加大酶的用量，加大酶的用量，1 1 m mg DNA g DNA 用用 10 10U U 酶酶加大反应总体积加大反应总体积延长反应时间延长反应时间限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素DNADNA样品的甲基化程度：样品的甲基化程度：大肠杆菌中的大肠杆菌中的damdam甲基化酶在甲基化酶在5 5 GATC3GATC3 序列中的腺序列中的腺嘌呤嘌呤NN66位位 引入甲基，受其影响的酶有引入甲基，受其影响的酶有Bcl IBcl I、MboIMboI等，但等，但BamH IBamH I、Bgl IIBg
15、l II、Sau3A ISau3A I不受影响不受影响 大肠杆菌中的大肠杆菌中的dcmdcm甲基化酶在甲基化酶在5 5 CCAGG3CCAGG3 或或5 5 CCTGG3CCTGG3 序列序列中的中的胞嘧啶胞嘧啶CC55位位上引入甲基，上引入甲基，受其影响的酶有受其影响的酶有EcoR IIEcoR II等等哺乳动物中的甲基化酶在哺乳动物中的甲基化酶在5 5 CG3CG3 序列中的序列中的CC55位位上引入甲基上引入甲基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓冲液性质：核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、
16、极端高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pHpH值值等，等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的所谓的Star activityStar activity现象现象 EcoR IEcoR I在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割5 5 GAATTC3GAATTC3 序列，但在甘序列，但在甘油浓度超过油浓度超过5%5%（v/vv/v）时，也可切割时，也可切割5 5 PuPuATPyPy3PuPuATPyPy3 或者或者5 5 AATT3AATT3 DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质修
17、复双链修复双链DNADNA上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键DNADNA连接酶连接酶5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPP5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5nicknicknicknickDNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质修复与修复与RNARNA链
18、结合的链结合的DNADNA链上缺口处的磷酸二酯键链上缺口处的磷酸二酯键T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶5 5 GG-CC-UU-CC-UU-GG-CC-CC-GG-GG-AA-GG 3 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-GG-CC-CC-T T-C 5C 5OHOHPPnicknick5 5 GG-CC-UU-CC-UU-GG-CC-CC-GG-GG-AA-GG 3 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-GG-CC-CC-T T-C 5C 5DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子：
19、分子：5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG 333 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC 5 55 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-OHOH PP-CC-T T-GG-GG-AA-GG 333 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-PP OHOH-GG-AA-CC-CC-T T-CC 5 5 T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件Tris-HClTris-HCl50-100 mM pH 7.550-100 mM pH 7.5Mg
20、ClMgCl2210 mM10 mMATPATP0.5-1 mM0.5-1 mMDTTDTT5 mM5 mMVolumeVolume10-20 10-20 m ml lT TT T4-15 4-15 4-16 4-16 hrhr1 1 U DNAU DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 15 反应反应 1 1 小时，小时，完全连接完全连接 1 1 m mg g l l-DNA-DNA（Hind IIIHind III片段）所需的酶量片段）所需的酶量DNADNA连接酶连接酶平头双链平头双链DNADNA片段的连接操作片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性
21、核酸内切酶创造的粘性末端的从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（加大连接酶用量（1010倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入加入10%10%PEG8000PEG8000，促进大分子之间的有效作用促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（
22、加入单价阳离子（NaClNaCl），），最终浓度最终浓度150-200 150-200 mMmMDNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I（DNA pol I DNA pol I）5 5 5 5 3333 的的DNADNA聚合酶活聚合酶活性性5 5 5 5 3333 的核酸外切酶的核酸外切酶活性活性3 3 3 3 5555 的核酸外切酶活的核酸外切酶活性性大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I的基本性质：的基本性质：3 3 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-A 5A 55 5 CC-GG-AA-GG-T T-OH
23、OH5 5 ppp dN Mgppp dN Mg2+2+3 3 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-A 5A 55 5 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-OHOHDNA pol IDNA pol IDNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I（DNA pol I DNA pol I）缺口前移标记法缺口前移标记法大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 的基本用途：的基本用途：5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-A
24、A-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 MgMg2+2+5 5 dNTP dNTP 5 5 ppppp p dA dA（a a-3232P-dATPP-dATP）5 5 GG-CC-T T-C AC A-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T T 3 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 Ni
25、ck translationNick translation制备制备3232P P标记的探针标记的探针DNase IDNase IDNA pol IDNA pol IDNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本性质：酶的基本性质：大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得CC端端三分之二的大肽段，即为三分之二的大肽段，即为KlenowKlenow酶酶KlenowKlenow酶仍拥有酶仍拥有5 5 5 5 3333 的的DNADNA聚合
26、酶活性聚合酶活性和和3 3 3 3 5555 的核的核核酸外切酶活性核酸外切酶活性，但失去了，但失去了5 5 5 5 3333 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本用途：酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5 5 粘性末端粘性末端DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DNADNA序列序列DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADN
27、A聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本用途：酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5 5 粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-T T-GG-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-PP OHOH-GG-CC-T T-C 5 C 5 KlenowKlenowdATP dTTPdATP dTTP5 5 GG-CC-T T-GG-AA-AA-T T-T T-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G
28、 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-PP OHOH-T T-T T-AA-AA-GG-CC-T T-C 5 C 5 DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本用途：酶的基本用途：DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5 GG-CC-T T-GG-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-PP OHOH-GG-CC-T T-C 5 C 5 KlenowK
29、lenowaa-3232P-ppP-ppppdA dTTPdA dTTP5 5 GG-CC-T T-GG-AA-AA-T T-T T-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-PP OHOH-T T-T T-AA-AA-GG-CC-T T-C 5 C 5 DNADNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA酶的基本特性：酶的基本特性：在无在无dNTPdNTP时，可以从任何时，可以从任何3 3-OHOH端外切端外切在只有一种在只有一种dNTPdNTP时，外切至互补核苷酸暴露
30、时停止时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种在四种dNTPdNTP均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，聚合活性占主导地位5 5 5 5 3333 的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3 3 3 3 5555 的核酸外切的核酸外切酶活性酶活性DNADNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的切平由核酸内切酶产生的3 3 粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-PP HOHO-AA-CC-G
31、G-T T-CC-CC-T T-C 5 C 5 T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶5 5 GG-CC-T T-CC-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-PP HOHO-CC-CC-T T-C 5C 5注意：该酶也能降解双链注意：该酶也能降解双链DNADNA，只是其活性比单链降解活性低很多只是其活性比单链降解活性低很多DNADNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-
32、GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 MgMg2+2+55ppp dN ppp dN 55 pppppp dA dA（aa-3232P-dATPP-dATP）5 5 GG-CC-T T-C AC A-GG-CC-T T-GG-OHOH HOHO-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 T4-DNA polT4-DNA polT4-DNA polT4-DNA pol5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T T 333 3 CC-GG
33、-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 DNADNA聚合酶聚合酶依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：以以RNARNA为模板聚合为模板聚合cDNAcDNA链链3 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA反转录酶反转录酶MgMg2+2+dNTP dNTP5 5TTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT oligo(dT)oligo(dT)12-1812-183 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAm
34、RNA5 5TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT33cDNAcDNADNADNA聚合酶聚合酶依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：双向外切双向外切DNA-RNADNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNARNA链链反转录酶反转录酶3 RNA3 RNA55 DNADNA33553 RNA3 RNA55 DNADNA3355反转录酶反转录酶55 DNADNA33核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Asp
35、ergillus oryzaeAspergillus oryzae）ZnZn2+2+必需必需最适最适pHpH范围为范围为4.0-4.34.0-4.3需要需要NaCl 10-300 mMNaCl 10-300 mM降解单链降解单链DNADNA的速度比降解双链的速度比降解双链DNADNA快快7500075000倍倍降解单链降解单链DNADNA的速度比降解单链的速度比降解单链RNARNA快快7 7倍倍核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本反应：核酸酶的基本反应：内切单链内切单链DNADNA或或RNARNA5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC
36、-T T-CC-T T-T T-GG-AA-GG-GG-AA-GG-T 3T 3S1S1ZnZn2+2+5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-C TC T-T T-GG-AA-GG-GG-AA-GG-T 3T 35 5 GG-CC-T T-C AC A-GG-CC-T T-C TC T-T T-GG-AA-G GG G-AA-GG-T 3T 35 5 dNMPs dNMPs 或或 5 5 NMPsNMPs核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本反应：核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链内切带缺口或缺刻的双链DNADNA或或R
37、NARNA5 5 GG-CC-T T-CC-AA-G CG C-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 nicknickgapgapS1S1ZnZn2+2+5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG3 3 CC-GG-AA-GG-T T-CCT T-GG-GG-AA-GG-T 3T 3AA-CC-CC-
38、T T-CC-A A 5 5 核酸酶核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：单链内切双链外切的核酸酶：Bal31Bal31核酸酶核酸酶Bal31Bal31核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejianaA.espejiana）CaCa2+2+5 5 dNMPs dNMPs 或或 5 5 NMPsNMPsssDNA or RNAssDNA or RNACaCa2+2+CaCa2+2+核酸酶核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：单链内切双链外切的核酸酶：Bal31Bal31核酸酶核酸酶Bal31Bal31核酸酶的基本用途：诱发核酸酶的基本用途：诱发DNADNA突
39、变突变EcoRIEcoRIAABBCCEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBBCCAABal31Bal31BBCCAA环化环化AACC核酸修饰酶核酸修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（末端脱氧核苷酰转移酶（TdTTdT）TdTTdT的基本特性：来自小牛胸腺的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的不需要模板的DNADNA聚合酶，聚合酶，随机掺入随机掺入dNTPsdNTPs5 p3 HOOH 3p 5TdTTdTMgMg2+2+dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAA OH 3p 5TdTTdT的基本特性：的基本特性：5 p3 HOOH 3p 5TdTTdTCoCo2+2+dATPdATP5
40、 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCoCo2+2+dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 AAAAAAAAAAA核酸修饰酶核酸修饰酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIPCIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAPBAP）5 pOH 3 DNA or RNA5 ppp dN5 pppNBAP/CIPBAP/CIPOH 3 5 HO5 HO dN5 HO N核酸修饰酶核酸修饰酶T4-T4-
41、多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（T4-PNPT4-PNP）T4-PNPT4-PNP的基本特性：在的基本特性：在DNADNA、RNARNA、dNRdNR、NRNR的的5-5-OHOH上加磷上加磷5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPT4-PNPMgMg2+2+p pppATPppATP（g g-3232P-ATPP-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 用于探针的末端同位素标记：用于探针的末端同位素标记：B B 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体2 2 重组重组DNADNA技术所需的基本条件技术所需的基本条件质粒（质粒（plasmidplasmid）噬菌体或病毒噬菌体或病毒DN
42、ADNA考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）人造染色体载体人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的功能及特征载体的功能及特征载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较高的外源高的外源DNADNA的载装能力的
43、载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并能被稳定遗传的一类核酸分子；能被稳定遗传的一类核酸分子；质粒常见于原核细菌和真菌中；质粒常见于原核细菌和真菌中；绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNADNA型的，绝大多数的天然型的，绝大多数的天然DNADNA质粒具有共价质粒具有共价封闭、环状的分子结构，即封闭、环状的分子结构
44、，即cccDNAcccDNA；质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：1-300 1-300 kbkb质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制；复制系统进行自主复制；质粒质粒DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒 1-3 1-3 拷贝拷贝 stringent pla
45、smidstringent plasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 10-60 10-60 拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控复制启动控制制控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合orioriE.coli E.coli ColE1ColE1 plasmidplasmid复制方向复制方向roprop（+）RopRopRNA IIRNA IIRNA IRNA I33555533质粒质粒质粒的基本特
46、征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控复制启动控制制控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（oriori）的结合的结合PcopPcopcopcopP/OrepP/OreprepreporioriCopCopRepRep质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性：质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，一般不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，一般不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相
47、容性的质粒组ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101pSC101、F F、RP4 RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15Ap15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容成成不相容性群不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：。以大肠杆菌的质粒为例：质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的可转移性：质粒的可转移性：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另
48、一个：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如细胞（接合作用），如F F、ColCol、RR质粒等；质粒等；非接合型质粒非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。：不能在天然条件下独立地发生接合作用。值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1ColE1）在接合型质粒的存在在接合型质粒的存在和协助下，也能发生和协助下，也能发生DNADNA转移，这个过程由转移，这个过程由bombom和和mobmob基因决定。基因决定。质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征携带特殊的遗传标记：携带特殊的遗传标记：野生型的质粒野生型的质粒DNADNA上往往携
49、带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义。重组分子的筛选具有重要意义。质粒质粒质粒的构建质粒的构建 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体
50、的要求，因此往往需要以多遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建而成的：多是由少数几个野生型质粒构建而成的：pSC101pSC1018.8 kb8.8 kb，拷贝数，拷贝数 5 5，四环素抗性标记基因，四环素抗性标记基因 TcTcrrColE1ColE16.5 kb6.5 kb，拷贝数，拷贝数 20 20-30-30，大肠杆菌内毒素标记基因，大肠杆菌内毒素标记基因 E1E1RSF2124RSF2124ColE1ColE1衍