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1、1q分离目的基因的方法及原理分离目的基因的方法及原理q目的基因分离方法的选择原则目的基因分离方法的选择原则q目的基因的序列测定目的基因的序列测定本节内容本节内容第1页/共57页2目的基因的定义目的基因的定义目的基因的定义目的基因的定义：target genetarget genetarget genetarget gene对基因组中某一基因成分或该基因片段进行研对基因组中某一基因成分或该基因片段进行研对基因组中某一基因成分或该基因片段进行研对基因组中某一基因成分或该基因片段进行研究究究究 或应用，首先需要通过克隆、扩增以获得该基或应用，首先需要通过克隆、扩增以获得该基或应用，首先需要通过克隆、
2、扩增以获得该基或应用，首先需要通过克隆、扩增以获得该基因，因，因，因，此基因（或片段）称为目的基因。此基因（或片段）称为目的基因。此基因（或片段）称为目的基因。此基因（或片段）称为目的基因。外源性基因（或外源性基因（或外源性基因（或外源性基因（或DNADNADNADNA）：）：）：）：cloned DNA in vitro插入至载体、并导入宿主细胞内复制的基因。插入至载体、并导入宿主细胞内复制的基因。插入至载体、并导入宿主细胞内复制的基因。插入至载体、并导入宿主细胞内复制的基因。第一节第一节 分离目的基因的方法及原理分离目的基因的方法及原理1第2页/共57页3 DNADNADNADNA重组技术
3、：重组技术：重组技术：重组技术：按照人的意愿在体外对按照人的意愿在体外对按照人的意愿在体外对按照人的意愿在体外对 DNA DNA DNA DNA 分子进行重组，分子进行重组，分子进行重组，分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中 扩增和繁殖，以获得该扩增和繁殖，以获得该扩增和繁殖，以获得该扩增和繁殖，以获得该DNADNADNADNA分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。第3页/共57页4目的基因的来源目的基因的来源从庞大的基因群中获得某一目的基
4、因的从庞大的基因群中获得某一目的基因的从庞大的基因群中获得某一目的基因的从庞大的基因群中获得某一目的基因的DNA DNA DNA DNA 片段要求片段要求片段要求片段要求 纯度高；纯度高；纯度高；纯度高；数量多数量多数量多数量多原核细胞（较易获得目的基因）原核细胞（较易获得目的基因）原核细胞（较易获得目的基因）原核细胞（较易获得目的基因）基因组较小，可直接分离获得基因组较小，可直接分离获得基因组较小，可直接分离获得基因组较小，可直接分离获得 基因组基因组基因组基因组 限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶 水解成若水解成若水解成若水解成若干干干干 片段片段片段片段 探针筛选探针筛选探
5、针筛选探针筛选 提纯提纯提纯提纯 扩增扩增扩增扩增 第4页/共57页第5页/共57页6真核生物：一个单拷贝基因仅占整个基因组真核生物：一个单拷贝基因仅占整个基因组真核生物：一个单拷贝基因仅占整个基因组真核生物：一个单拷贝基因仅占整个基因组的的的的 10101010-5-5-5-5甚至更少，不易获得。甚至更少，不易获得。甚至更少，不易获得。甚至更少，不易获得。真核细胞目的基因的来源根据不同要求选择真核细胞目的基因的来源根据不同要求选择真核细胞目的基因的来源根据不同要求选择真核细胞目的基因的来源根据不同要求选择 1.1.1.1.构建构建构建构建 cDNAcDNAcDNAcDNA文库文库文库文库 2
6、.2.2.2.构建基因组文库构建基因组文库构建基因组文库构建基因组文库 3.3.3.3.人工合成人工合成人工合成人工合成 Synthesize DNA in vitroSynthesize DNA in vitroSynthesize DNA in vitroSynthesize DNA in vitro 4.PCR 4.PCR 4.PCR 4.PCR扩增扩增扩增扩增第6页/共57页7DNADNA文库：文库：通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种DNADNADNADNA分子的集合体。文库保
7、分子的集合体。文库保分子的集合体。文库保分子的集合体。文库保存了该种生物的全部遗传信息，需要时可从中分离获得。存了该种生物的全部遗传信息，需要时可从中分离获得。存了该种生物的全部遗传信息，需要时可从中分离获得。存了该种生物的全部遗传信息，需要时可从中分离获得。1.cDNA1.cDNA1.cDNA1.cDNA文库文库文库文库 只包括表达成蛋白质的只包括表达成蛋白质的只包括表达成蛋白质的只包括表达成蛋白质的DNADNADNADNA序列序列序列序列2.2.2.2.基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库代表该种生物体所有的代表该种生物体所有的代表该种生物体所有的代表该种生物体所有的DNADNADNA
8、DNA序列序列序列序列 第7页/共57页8cDNA cDNA (互补互补DNA,complementary DNA)DNA,complementary DNA)qq区域特异性区域特异性区域特异性区域特异性cDNAcDNAcDNAcDNA文库文库文库文库 从特定位点从特定位点从特定位点从特定位点的基因组的基因组的基因组的基因组DNADNADNADNA出发寻找转录序列出发寻找转录序列出发寻找转录序列出发寻找转录序列 即以含有某种人染色体或其区段的杂即以含有某种人染色体或其区段的杂即以含有某种人染色体或其区段的杂即以含有某种人染色体或其区段的杂交细胞株分离交细胞株分离交细胞株分离交细胞株分离RNA,
9、RNA,RNA,RNA,反转录合成反转录合成反转录合成反转录合成cDNAcDNAcDNAcDNA 分类分类分类分类:用人特异性用人特异性用人特异性用人特异性AluAluAluAlu序列扩序列扩序列扩序列扩增，寻找外显子，可以增，寻找外显子，可以增，寻找外显子，可以增，寻找外显子，可以得到染色体段内表达基得到染色体段内表达基得到染色体段内表达基得到染色体段内表达基因的分布图因的分布图因的分布图因的分布图第8页/共57页9qq组织特异性组织特异性组织特异性组织特异性cDNAcDNAcDNAcDNA文库文库文库文库 从从从从cDNAcDNAcDNAcDNA出发出发出发出发寻找转录序列，将其定位于遗传
10、图谱或寻找转录序列，将其定位于遗传图谱或寻找转录序列，将其定位于遗传图谱或寻找转录序列，将其定位于遗传图谱或物理图谱上。物理图谱上。物理图谱上。物理图谱上。即以不同发育阶段的人组织细胞为材即以不同发育阶段的人组织细胞为材即以不同发育阶段的人组织细胞为材即以不同发育阶段的人组织细胞为材料，提取料，提取料，提取料，提取RNARNARNARNA，构成，构成，构成，构成cDNAcDNAcDNAcDNA文库。文库。文库。文库。可得到特定细胞的外显子图谱可得到特定细胞的外显子图谱可得到特定细胞的外显子图谱可得到特定细胞的外显子图谱第9页/共57页10一、构建一、构建cDNAcDNA文库文库 cDNAcDN
11、A以以mRNAmRNA为模板经逆转录而成，为模板经逆转录而成，故须选择故须选择mRNAmRNA丰富、较易获得的、目的丰富、较易获得的、目的基因表达活跃的组织细胞为材料。基因表达活跃的组织细胞为材料。第10页/共57页111.1.真核细胞真核细胞mRNAmRNA的分离和纯化的分离和纯化 提取细胞内总提取细胞内总提取细胞内总提取细胞内总RNARNARNARNA 分离和纯化分离和纯化分离和纯化分离和纯化mRNAmRNAmRNAmRNA mRNA 3 mRNA 3 mRNA 3 mRNA 3 端有端有端有端有polyApolyApolyApolyA尾，用尾，用尾，用尾，用oligo-dToligo-d
12、Toligo-dToligo-dT纤维纤维纤维纤维 素亲和柱分离纯化素亲和柱分离纯化素亲和柱分离纯化素亲和柱分离纯化mRNAmRNAmRNAmRNA。第11页/共57页12第12页/共57页2.2.逆转录合成逆转录合成cDNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNA第一链合成第一链合成第一链合成第一链合成第13页/共57页14cDNAcDNAcDNAcDNA第一链合成的注意事项第一链合成的注意事项第一链合成的注意事项第一链合成的注意事项合成效率低合成效率低合成效率低合成效率低cDNAcDNAcDNAcDNA长度应为长度应为长度应为长度应为0.7-8kb0.7-8kb0.7-8kb0.7-8kb
13、各种反转录酶只能存于各种反转录酶只能存于各种反转录酶只能存于各种反转录酶只能存于-20-20-20-20，不可，不可，不可，不可-70-70-70-70 第14页/共57页方法：合成cDNA第一链 5AAAAAA 3 mRNA TTTTTTT 5 cDNA 1 Oligo(dT)，反转录酶 d NTP,合成cDNA第二链 AAAAAA 3 cDNA 2 TTTTTTT 5 RNase H，DNA聚合酶,dNTP 5 AAAAAA 3 双链 cDNA 3 TTTTTTT 5第15页/共57页PolyPoly（T T）引物）引物反转录酶反转录酶降解降解RNARNADNADNA聚合酶聚合酶S1S1酶
14、去除发夹酶去除发夹发夹发夹qcDNAcDNAcDNAcDNA第二链合成第二链合成第二链合成第二链合成 方法：自身引导法方法：自身引导法方法：自身引导法方法：自身引导法 第一链合成过程中形成第一链合成过程中形成第一链合成过程中形成第一链合成过程中形成cDNA/RNAcDNA/RNAcDNA/RNAcDNA/RNA杂交分子变性，杂交分子变性，杂交分子变性，杂交分子变性，降解降解降解降解RNARNARNARNA单链单链单链单链cDNAcDNAcDNAcDNA分子的分子的分子的分子的3 3 3 3 末端末端末端末端自身环化，形成发夹结构自身环化，形成发夹结构自身环化，形成发夹结构自身环化，形成发夹结构
15、以此为引物，在以此为引物，在以此为引物，在以此为引物，在DNADNADNADNA聚合聚合聚合聚合酶作用下合成第二链酶作用下合成第二链酶作用下合成第二链酶作用下合成第二链 缺点：缺点：缺点：缺点：S1S1S1S1核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶第16页/共57页q置换合成法置换合成法焦磷酸钠存在下合成焦磷酸钠存在下合成焦磷酸钠存在下合成焦磷酸钠存在下合成cDNAcDNAcDNAcDNA的第一链的第一链的第一链的第一链RNAaseHRNAaseHRNAaseHRNAaseH酶降解酶降解酶降解酶降解RNARNARNARNARNARNARNARNA链上出现切口链上出现切口链上出现切口链上出现切口产生一系列带产
16、生一系列带产生一系列带产生一系列带3 3 3 3-OH-OH-OH-OH的的的的RNARNARNARNA引物引物引物引物大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNADNADNA聚合酶合成聚合酶合成聚合酶合成聚合酶合成cDNAcDNAcDNAcDNA的第二链的第二链的第二链的第二链第17页/共57页18PCRPCR法法第18页/共57页193.3.构建构建cDNAcDNA文库文库（1 1 1 1）修饰）修饰）修饰）修饰cDNAcDNAcDNAcDNA两端两端两端两端 接头：人工合成的双链寡核苷酸，接头：人工合成的双链寡核苷酸，接头：人工合成的双链寡核苷酸，接头：人工合成的双链寡核苷酸，二端均为平
17、头或含酶切位点。二端均为平头或含酶切位点。二端均为平头或含酶切位点。二端均为平头或含酶切位点。衔接头：一端为平头，一端为粘末端。衔接头：一端为平头，一端为粘末端。衔接头：一端为平头，一端为粘末端。衔接头：一端为平头，一端为粘末端。第19页/共57页20 （2 2 2 2）cDNAcDNAcDNAcDNA与载体相连与载体相连与载体相连与载体相连 各各各各cDNAcDNAcDNAcDNA各自与一个载体在各自与一个载体在各自与一个载体在各自与一个载体在T4T4T4T4连接酶连接酶连接酶连接酶 作用下以粘末端互相连接，即为重组作用下以粘末端互相连接，即为重组作用下以粘末端互相连接，即为重组作用下以粘末
18、端互相连接，即为重组DNA DNA DNA DNA 分子。分子。分子。分子。第20页/共57页21 （3 3 3 3）导入宿主细胞）导入宿主细胞）导入宿主细胞）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞重组体在一定条件下导入宿主细胞重组体在一定条件下导入宿主细胞重组体在一定条件下导入宿主细胞培培培培 养或保存。养或保存。养或保存。养或保存。宿主细胞必须是来自一个细胞的克宿主细胞必须是来自一个细胞的克宿主细胞必须是来自一个细胞的克宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆隆隆隆 体，以保证它们的遗传性状相同。体，以保证它们的遗传性状相同。体，以保证它们的遗传性状相同。体，以保证它们的遗传性状相同。第21
19、页/共57页224.4.筛选目的基因筛选目的基因 核酸杂交法核酸杂交法：cDNAcDNAcDNAcDNA克隆（菌斑或噬菌斑）克隆（菌斑或噬菌斑）克隆（菌斑或噬菌斑）克隆（菌斑或噬菌斑）硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜 杂交（杂交（杂交（杂交（DNADNADNADNA探针）探针）探针）探针）显影定位显影定位显影定位显影定位 挑选挑选挑选挑选 培养扩增培养扩增培养扩增培养扩增 纯化纯化纯化纯化第22页/共57页23第23页/共57页24第24页/共57页2523第25页/共57页26二、构建基因组文库二、构建基因组文库1.1.1.1.分离纯化基因组分离纯化基因组分离纯化基因组分离纯
20、化基因组DNADNADNADNA 条件应温和，以保证得到较长的条件应温和，以保证得到较长的条件应温和，以保证得到较长的条件应温和，以保证得到较长的DNADNADNADNA链链链链2.DNA2.DNA2.DNA2.DNA片段与载体连接片段与载体连接片段与载体连接片段与载体连接 基因组基因组基因组基因组DNA DNA DNA DNA 酶水解酶水解酶水解酶水解 具一定长度的片具一定长度的片具一定长度的片具一定长度的片段段段段 （粘性末端）（粘性末端）（粘性末端）（粘性末端）载体（噬菌体等）载体（噬菌体等）载体（噬菌体等）载体（噬菌体等）酶解酶解酶解酶解 与目的基因连与目的基因连与目的基因连与目的基因
21、连接接接接第26页/共57页27 3.3.3.3.导入宿主细胞：导入宿主细胞：导入宿主细胞：导入宿主细胞：携带基因组携带基因组携带基因组携带基因组DNADNADNADNA片段的噬菌体或粘粒经片段的噬菌体或粘粒经片段的噬菌体或粘粒经片段的噬菌体或粘粒经 包装后转入宿主细胞内培养扩增。包装后转入宿主细胞内培养扩增。包装后转入宿主细胞内培养扩增。包装后转入宿主细胞内培养扩增。插入基因组片段的集合体即基因组文库。插入基因组片段的集合体即基因组文库。插入基因组片段的集合体即基因组文库。插入基因组片段的集合体即基因组文库。第27页/共57页284.4.4.4.筛选目的基因筛选目的基因筛选目的基因筛选目的基
22、因 原核细胞不可用来作为基因的表达系原核细胞不可用来作为基因的表达系原核细胞不可用来作为基因的表达系原核细胞不可用来作为基因的表达系统统统统（无转录后加工）。（无转录后加工）。（无转录后加工）。（无转录后加工）。原核细胞基因库原核细胞基因库原核细胞基因库原核细胞基因库只能用核酸探针只能用核酸探针只能用核酸探针只能用核酸探针杂杂杂杂 交筛选目的基因。交筛选目的基因。交筛选目的基因。交筛选目的基因。第28页/共57页29三、人工合成目的基因三、人工合成目的基因DNADNA片段片段1.DNA1.DNA1.DNA1.DNA的化学合成的化学合成的化学合成的化学合成2.DNA2.DNA2.DNA2.DNA
23、的酶促合成（首先需要有目的基因的酶促合成（首先需要有目的基因的酶促合成（首先需要有目的基因的酶促合成（首先需要有目的基因 DNADNADNADNA或与之互补的或与之互补的或与之互补的或与之互补的RNARNARNARNA链作为模板）链作为模板）链作为模板）链作为模板）第29页/共57页30四、聚合酶链反应合成四、聚合酶链反应合成四、聚合酶链反应合成四、聚合酶链反应合成DNADNADNADNA片段片段片段片段 （见PCR章）4第30页/共57页31五、其他方法五、其他方法 1.1.1.1.构建差示文库构建差示文库构建差示文库构建差示文库(differential library)(differen
24、tial library)(differential library)(differential library)差示文库：反映不同组织细胞或同一种细胞差示文库：反映不同组织细胞或同一种细胞在不同功能状态下基因表达差异的在不同功能状态下基因表达差异的 cDNAcDNA文文库。库。研究目的：研究细胞的发育、分化、细胞的研究目的：研究细胞的发育、分化、细胞的分裂周期、细胞对药物和生长因子的诱导反分裂周期、细胞对药物和生长因子的诱导反应以及肿瘤等疾病。应以及肿瘤等疾病。第31页/共57页差示文库构建流程F细胞mRNA。F细胞中特异表达的cDNA文库（即差示文库）（F细胞cDNA第一链）代表F细胞特异
25、表达的基因（H细胞mRNA）。第32页/共57页332.mRNA2.mRNA差异显示差异显示(differential(differential display)display)(1)PCR(1)PCR(1)PCR(1)PCR扩增扩增扩增扩增(2)(2)(2)(2)电泳分离（测序胶）电泳分离（测序胶）电泳分离（测序胶）电泳分离（测序胶）PCRPCRPCRPCR产物在产物在产物在产物在4%4%4%4%的测序胶上进行电泳的测序胶上进行电泳的测序胶上进行电泳的测序胶上进行电泳cDNAcDNAcDNAcDNA单链被分离，在对应组间可发现单链被分离，在对应组间可发现单链被分离，在对应组间可发现单链被分离
26、，在对应组间可发现cDNAcDNAcDNAcDNA的差异的差异的差异的差异模板：一组对应的模板：一组对应的模板：一组对应的模板：一组对应的RNARNARNARNA或或或或mRNAmRNAmRNAmRNA引物：引物：引物：引物：逆转录合成的逆转录合成的逆转录合成的逆转录合成的cDNAcDNAcDNAcDNA可覆盖所有可覆盖所有可覆盖所有可覆盖所有mRNAmRNAmRNAmRNA，再行，再行，再行，再行PCRPCRPCRPCR扩增。扩增。扩增。扩增。第33页/共57页34第二节第二节 目的基因分离方法的选择原则目的基因分离方法的选择原则第34页/共57页35一、根据获得目的基因的目的选择方一、根据
27、获得目的基因的目的选择方法法基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库 基因组全部测序、结构分析、基因识别，基因组全部测序、结构分析、基因识别，基因组全部测序、结构分析、基因识别，基因组全部测序、结构分析、基因识别，需构建基因组文库，从中获得基因（需构建基因组文库，从中获得基因（需构建基因组文库，从中获得基因（需构建基因组文库，从中获得基因（HGPHGPHGPHGP）。）。）。）。cDNAcDNAcDNAcDNA文库文库文库文库 研究基因表达或大量合成多肽、蛋白质用研究基因表达或大量合成多肽、蛋白质用研究基因表达或大量合成多肽、蛋白质用研究基因表达或大量合成多肽、蛋白质用于生物制药等。于生物制药
28、等。于生物制药等。于生物制药等。差异显示差异显示差异显示差异显示 对比某一种或几种变异的基因（差异）。对比某一种或几种变异的基因（差异）。对比某一种或几种变异的基因（差异）。对比某一种或几种变异的基因（差异）。第35页/共57页36二、根据目的基因的特点选择方法二、根据目的基因的特点选择方法 基因组文库：基因组文库：基因组文库：基因组文库：cDNAcDNAcDNAcDNA文库：文库：文库：文库：P C RP C RP C RP C R：包括某种生物的全部遗传信息，包括某种生物的全部遗传信息，包括某种生物的全部遗传信息，包括某种生物的全部遗传信息，任何信息都可从中筛选，但某任何信息都可从中筛选，
29、但某任何信息都可从中筛选，但某任何信息都可从中筛选，但某一个基因在其中所占比例很小，一个基因在其中所占比例很小，一个基因在其中所占比例很小，一个基因在其中所占比例很小，筛选难度大。筛选难度大。筛选难度大。筛选难度大。包含所有正在表达的包含所有正在表达的包含所有正在表达的包含所有正在表达的mRNAmRNAmRNAmRNA基因，基因，基因，基因，不包含基因中的内含子和不包含基因中的内含子和不包含基因中的内含子和不包含基因中的内含子和rRNArRNArRNArRNA、tRNAtRNAtRNAtRNA等基因及所有不转录部等基因及所有不转录部等基因及所有不转录部等基因及所有不转录部分。分。分。分。须知与
30、目的基因特异互补的二须知与目的基因特异互补的二须知与目的基因特异互补的二须知与目的基因特异互补的二端的引物。端的引物。端的引物。端的引物。第36页/共57页37三、根据实验室的设备和条件选择方法三、根据实验室的设备和条件选择方法已有多种哺乳动物的已有多种哺乳动物的已有多种哺乳动物的已有多种哺乳动物的cDNAcDNAcDNAcDNA文库商品化，只要有文库商品化，只要有文库商品化，只要有文库商品化，只要有与目的基因互补的探针，便可筛选。与目的基因互补的探针，便可筛选。与目的基因互补的探针，便可筛选。与目的基因互补的探针，便可筛选。具备具备具备具备PCRPCRPCRPCR仪、仪、仪、仪、DNADNA
31、DNADNA合成仪等，均可采用相应方法合成仪等，均可采用相应方法合成仪等，均可采用相应方法合成仪等，均可采用相应方法获得目的基因。获得目的基因。获得目的基因。获得目的基因。第37页/共57页38第三节第三节 目的基因序列测定目的基因序列测定目的基因序列测定目的基因序列测定精确研究该基因结构和功能的前提精确研究该基因结构和功能的前提发现异常基因的依据。发现异常基因的依据。第38页/共57页39一、双脱氧链终止法（一、双脱氧链终止法（SangerSanger法）法）原理 DNADNADNADNA链中的戊糖在链中的戊糖在链中的戊糖在链中的戊糖在3 3 3 3 位碳原子上有位碳原子上有位碳原子上有位碳
32、原子上有-OH-OH-OH-OH基团，基团，基团，基团，在在在在 DNADNADNADNA合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷 酸酸酸酸5 5 5 5-p-p-p-p与前一核苷酸的戊糖与前一核苷酸的戊糖与前一核苷酸的戊糖与前一核苷酸的戊糖3 3 3 3-OH-OH-OH-OH以磷酸二酯以磷酸二酯以磷酸二酯以磷酸二酯 键相连。键相连。键相连。键相连。第39页/共57页40SangerSangerSangerSanger法是在反应体系中加入法是在反应体系中加入法是在反应体系中加入法是
33、在反应体系中加入 2 2 2 2,3,3,3,3 -ddNTPddNTPddNTPddNTP，由于其没有，由于其没有，由于其没有，由于其没有 3 3 3 3-OH-OH-OH-OH 而不能与下一个核而不能与下一个核而不能与下一个核而不能与下一个核苷酸相连，于是苷酸相连，于是苷酸相连，于是苷酸相连，于是DNADNADNADNA链的合成便终止。链的合成便终止。链的合成便终止。链的合成便终止。第40页/共57页41第41页/共57页5GAGTCACACTTGAC 3待测单链DNA 3CTG 5引 物、Klenow酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和少量-32P-dATP 加ddATP反应3A
34、CTG 53AACTG 53AGTGTGAACTG 5加ddCTP反应3CAGTGTGAACTG 53CTCAGTGTGAACTG5加ddTTP反应3TGAACTG 53TGTGAACTG 53TCAGTGTGAACTG5加ddGTP反应3GAACTG 53GTGAACTG 53GTGTGAACTG5GAGTCACACTT变性凝胶电泳、放射自显影 A C T G 5第42页/共57页43第43页/共57页44第44页/共57页45模板模板 纯化的单链纯化的单链纯化的单链纯化的单链DNA DNA DNA DNA 片段，克隆入噬菌体片段，克隆入噬菌体片段，克隆入噬菌体片段，克隆入噬菌体M13M13
35、M13M13中中中中 变性的双链变性的双链变性的双链变性的双链DNADNADNADNA片段，克隆入片段，克隆入片段，克隆入片段，克隆入pUC,pGEM,pUC,pGEM,pUC,pGEM,pUC,pGEM,Bluescript Bluescript Bluescript Bluescript等质粒中等质粒中等质粒中等质粒中纯化的纯化的纯化的纯化的PCRPCRPCRPCR产物，不经亚克隆可直接作为测序模板产物，不经亚克隆可直接作为测序模板产物，不经亚克隆可直接作为测序模板产物，不经亚克隆可直接作为测序模板 第45页/共57页46引物引物 与模板链特定序列互补的寡核苷酸与模板链特定序列互补的寡核苷
36、酸与模板链特定序列互补的寡核苷酸与模板链特定序列互补的寡核苷酸 通用引物通用引物通用引物通用引物 与位于靶与位于靶与位于靶与位于靶DNADNADNADNA侧翼的载体序列相互补的寡侧翼的载体序列相互补的寡侧翼的载体序列相互补的寡侧翼的载体序列相互补的寡 核苷酸（核苷酸（核苷酸（核苷酸（1529nt1529nt1529nt1529nt）特异引物特异引物特异引物特异引物 与靶与靶与靶与靶DNADNADNADNA链序列互补的寡核苷酸链序列互补的寡核苷酸链序列互补的寡核苷酸链序列互补的寡核苷酸第46页/共57页47DNADNA聚合酶聚合酶KlenowKlenowKlenowKlenow片段片段片段片段
37、大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I I I大片段，持续合成能大片段，持续合成能大片段，持续合成能大片段，持续合成能 力较低、随机从模板解离而终止链的延伸力较低、随机从模板解离而终止链的延伸力较低、随机从模板解离而终止链的延伸力较低、随机从模板解离而终止链的延伸SequenaseSequenaseSequenaseSequenase 经化学修饰的经化学修饰的经化学修饰的经化学修饰的 T7T7T7T7噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNADNADNA聚合酶，活性聚合酶，活性聚合酶，活性聚合酶，活性 稳定，持续合成能力强，聚合速度高稳定，持续合成能力
38、强，聚合速度高稳定，持续合成能力强，聚合速度高稳定，持续合成能力强，聚合速度高第47页/共57页48序列识读序列识读 自下而上，自下而上，自下而上，自下而上，5 5 5 5 3 3 3 3 所读序列为模板的互补链所读序列为模板的互补链所读序列为模板的互补链所读序列为模板的互补链第48页/共57页49二、化学裂解法（二、化学裂解法（Maxam-GilbertMaxam-Gilbert法）法）原理原理 使特定的碱基首先被化学修饰，然后再经化学使特定的碱基首先被化学修饰，然后再经化学处理。如：用硫酸二甲酯使鸟嘌呤甲基化，然处理。如：用硫酸二甲酯使鸟嘌呤甲基化，然后再加哌啶，使甲基化的鸟嘌呤丢失，后再
39、加哌啶，使甲基化的鸟嘌呤丢失，DNADNA链链从鸟嘌呤修饰处后的从鸟嘌呤修饰处后的3 3，5 5-磷酸二酯键断裂。磷酸二酯键断裂。第49页/共57页50三、自动测序仪测序法三、自动测序仪测序法 (ABI)(ABI)自动测序仪基于自动测序仪基于2 2，3-3-双脱氧末端终止法的原理，双脱氧末端终止法的原理，标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光染料，预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷染料，预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷酸共价相连，使其带有不同的荧光标记。当某一种酸共价相连，使其带有不同的荧光标记。当某一种ddNTPddNTP掺入到正在
40、合成的掺入到正在合成的DNADNA单链分子中时，该单链分子中时，该链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装置、计算机成像系统及分析软件组合。置、计算机成像系统及分析软件组合。6第50页/共57页51序序 列列 图图 谱谱(ABI PRISM 377)第51页/共57页52第52页/共57页53第53页/共57页54四、测序策略四、测序策略确证性测序确证性测序确证性测序确证性测序 次级克隆次级克隆次级克隆次级克隆DNADNADNADNA的插入方向，定点突变、删切的插入方向，定点突变、删
41、切的插入方向，定点突变、删切的插入方向，定点突变、删切 产物的鉴定、待表达基因阅读框架的确认等产物的鉴定、待表达基因阅读框架的确认等产物的鉴定、待表达基因阅读框架的确认等产物的鉴定、待表达基因阅读框架的确认等未知序列的测定未知序列的测定未知序列的测定未知序列的测定 确定一个未知确定一个未知确定一个未知确定一个未知DNADNADNADNA序列的准确长度和核甘酸序列的准确长度和核甘酸序列的准确长度和核甘酸序列的准确长度和核甘酸 排列顺序排列顺序排列顺序排列顺序第54页/共57页55大片段未知序列的测定策略大片段未知序列的测定策略 随机克隆法（先水解再亚克隆）随机克隆法（先水解再亚克隆）随机克隆法（先水解再亚克隆）随机克隆法（先水解再亚克隆）限制性酶切片段亚克隆法限制性酶切片段亚克隆法限制性酶切片段亚克隆法限制性酶切片段亚克隆法 互套缺失法（定向连续次级克隆互套缺失法（定向连续次级克隆互套缺失法（定向连续次级克隆互套缺失法（定向连续次级克隆）第55页/共57页56复习思考题简述双脱氧末端终止法测序的原理。简述双脱氧末端终止法测序的原理。简述双脱氧末端终止法测序的原理。简述双脱氧末端终止法测序的原理。第56页/共57页57感谢您的观看。第57页/共57页