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1、试验方案试验外周血淋巴细胞培育及染色体标本制备，染色体组型分析一、试验目的1、了解动物细胞培育的方法。把握人体外周血淋巴细胞培育与染色体标本制备。2、初步把握人类染色体 G带的显示方法及人类染色体G带在染色体识别中的意义。3、生疏人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步把握人类染色体G 带的特征及其识别。二、试验原理所谓外周血培育即是将外周血接种在适当的培培育物中参与适量的秋水仙素，使纺锤体 微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液一般是0.075mol/L 的 KCl处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一局部细胞质除去，最终以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进展
2、培育。人类外周血细胞原来是终末分化细胞，一 般没有分裂力气，但经 PHA植物血球凝集素或 ConA 等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。染色体显带是将染色体标本经过确定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴 显现明暗或深浅相间的横行带纹染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带， 人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可觉察染色体上较微小的构造 变化。在全部的显带技术中，G 显带G banding是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa 染液染色，在一般显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G 带G band。G 显带方法简
3、便，带纹清楚，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和争辩。正常人类染色体的数目为 46 条(23 对)，1960 年的 Denver 会议和 1963 年的 London 会议制定了统一的人类染色体命名体制：依据染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染 色体22 对按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为122 号，性染色体用X 和 Y 标记； 并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母AG 表示。染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征见下表。依据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或构造畸变。表 1 人染色体组型及其特征组别染色体
4、序号形态，大小着丝点位置次缢痕随体A13最大中部着丝粒1，3亚中部着丝粒21 号染色体B45次大亚中部着丝粒C612X中等亚中部着丝粒9 号染色体D1315中等近端着丝粒有E1618小中部着丝粒亚中部着丝粒16 号染色体F1920次小中部着丝粒G2122Y最小近端着丝粒有三、试验试剂与器材试剂：抗凝剂：肝素溶液500U/ml；培育基：RPMI1640, 依据说明书配制后抽滤、分装，冻存备用。小牛血清：市售，冰冻保存，用时在56水浴条件灭活。植物血球凝集素PHA：市售，按说明书要求使用抗菌素：青霉素：50000U/ml，链霉素：50000ug/ml，均用无菌生理盐水配制中的终浓度均为 100 U
5、/ml5%NaHCO3秋水仙素：20ug/ml低渗溶液：0.075mol/L 氯化钾固定液：甲醇：冰乙酸3：1胰蛋白酶溶液：用灭菌生理盐水配制成0.1%的胰蛋白酶溶液，用 3%Tris 溶液调整pH至 7.0。Giemsa 染液：磷酸缓冲液pH6.810ml 加 Giemsa 原液 0.3ml，用时配制。器材：光学显微镜 1 台，离心机 1 台，恒温水浴箱 1 台，恒温箱 1 台，离心管 3支，量简 2 个，烧杯 2 只，培育瓶 3 个，冷湿载玻片 3 张，玻片架 1 台，注射器 1支，碘酒和酒精棉球，酒精灯，1 台，天平 1 台，一般冰箱 1 台，立式染缸 1 个、染色架 1 个、镊子 3
6、个，直头小吸管 3 支、橡皮吸头 3 个、吸水纸 假设干，香柏油， 擦镜纸，剪子 1 个，胶水。正常人类染色体G 带核型图，核型报告纸四、试验方法一培育液配制在超静工作台内无菌操作；每个培育瓶容积 30ml中参与 5ml 培育液，其中含： RPMI16404ml灭活小牛血清 1ml PHA2.5mg青霉素500U链霉素500ug依次将上述试剂参与培育瓶中，反复吹打使其混合均匀，用 5%NaHCO3 调整培育基的pH 值至 7.2-7.4。二采血与培育：先以碘酒和 75%乙醇消毒皮肤。用 2ml 灭菌注射器吸取约 0.2ml肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血 1ml。转动针筒以混匀肝素常规消毒后，
7、马上将针头插入灭菌小瓶内，送入超净工作台 ，在火焰旁将血液滴入 2 3 个盛有 5ml 培育液的培育瓶内，每瓶0.20.3ml6 号针头 45 度倾斜，约20 滴，盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培育瓶放在37恒温箱内静置培育 72h。每天摇动培育瓶一次三秋水仙素处理:向经恒温培育 68-72 小时的外周血淋巴细胞培育液中参与秋水仙素，使其终浓度为0.4 ug/ml,即每瓶内装 5ml 培育基中用 6 号针头倾斜 45 度角滴 4 滴，轻轻将液体摇匀， 连续恒温培育 2-3 小时。四标本的制备:1、终止培育后，将培育物混匀，倒人离心管内，离心沉淀10 分钟(2023r/min)，弃去上
8、清液。2、参与 37预温的低渗液 8m1，轻轻打匀，置 37水浴箱中 1520 分钟。使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。3、低渗处理完毕后，直接参与配的固定液1 m1 进展预固定，混匀后，离心10 分钟(2023r/min)。4、弃去上清液，沿离心管壁缓慢参与固定液4m1，轻轻吹打混匀，置室温 15 分钟。5、离心沉淀 2023 r/min，10 分钟。6、弃去上情液，再参与固定液 4m1 吹打均匀重悬细胞，固定 10 分钟。7、离心沉淀 2023 r/min，10 分钟。8、重复固定一次。9、尽量吸净上清液，视管底剩下的细胞多少参与适量固定液(0.30.6m1)，轻轻吹打成细胞悬液。10
9、、滴片：取保存在冰水中的冷湿载玻片 1 张，稍倾斜，用滴管吸取细胞悬液，从 3040cm 高处滴 2 滴于玻片上，马上用口对准玻片吹气，使细胞在玻片上散开，然后在酒精灯上略烘一下(勿全烘干，过火 3-5 次)，在空气中待干。四染色：1、常规制备的染色体标本片室温放置3 天老化后或37枯燥 20 小时，转移到80烤箱内枯燥 23 小时，自然冷却至室温后取出；2、将标本片放入盛有胰蛋白酶溶液预温至 37的染色缸中消化恒温。消化片子时， 一般预备 23 张片子，第一张一般在胰酶缓冲液中浸泡消化35S,而后染色镜检，如觉察细胞膨胀得不大，细胞膜没有裂开，染色体聚拢一团伸展不开，可依据具体状况，将消化时
10、间 延长 13s，而后再染色镜检3、将消化过的标本片马上放入Giemsa 染色液中，室温染色 30 分钟；4、自来水轻轻冲洗冲洗标本片的反面35 秒钟，晾干；5、镜下观看染色体分带及染色状况。五、试验结果1、观看自己制作的标本片中染色体的形态、颜色及其显带状况，记录并说明缘由。计数 10 个细胞的染色体数。2、试述染色体G 显带技术在人类染色体识别中的意义。3、绘出一套完整的中期分裂细胞的染色体图；依据课堂供给的材料，排列初一份正常人类染色体G 带核型图。4、试验报告六、留意事项一细胞培育技术1、在体外模拟体内的生理环境，培育从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培育技术。由于体外培
11、育的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。2、无菌操作的要领和要求1） 培育前预备 为做好培育前用品的充分预备工作，依据试验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避开操作开头后由于用品不全、往反取物而增加污染时机。2） 超净工作台消毒 翻开紫外线杀菌灯照耀消毒 20-30 分钟，然后关闭紫外灯翻开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。为防止培育细胞和培育液等受到紫外线照耀，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时顺手携入。3） 洗手 操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，确定要洗刷到肘部， 然后
12、用 0.2% 洁尔灭擦洗或用 75%酒精棉球擦试。4） 火焰消毒 在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、翻开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进展。留意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。烧过的用具都要待冷却后再接触细胞，否则会烧焦 形成炭膜，再用时会把有害物质带入培育液中。5） 操作 进展培育操作时动作要准确灵敏，但又不能太快，以防空气流淌增加污染时机。不能用手触及器皿的消毒局部。如已接触，要用火焰烧灼消毒或更换。为拿取便利，工作台面上的用品要有合理布局。原则上是右手使用便利的用品放在右侧，左手使用便利的用 品放在左侧；酒精灯置于中心。
13、培育液等不要过早开瓶，翻开的培育液和培育用瓶等应保持 斜位或平放，长时间开口直立，易增加落菌时机。吸取各种用液时均应分别使用吸管，不能 混用，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的时机。二染色体染色体是生物细胞中的一个重要的组成局部，每一物种都有确定数目及确定形态构造的染色体。染色体能通过细胞分裂而复制。并且在世代相传的过程中具有稳定地保持形态、构造和功能的特征。染色体是遗传物质的载体。人类 99%的遗传物质位于染色体上。染色体数目、构造的转变将导致染色体病。三操作1、接种的血样越颖越好，最好是在采血后 24h 内培育，如不能马上培育，应置于 4 冰箱存放，避开保存时间过久，以免影响细胞的活力。培育
14、过程中，如觉察血样凝集，可将培育瓶轻轻震荡，使凝块散开，连续放回37恒温箱内培育，最好每天轻轻震荡混匀一次。2、Giemsa 为噻嗪类染料 ,其碱性成份天青 B 与 DNA 分子中的磷酸基结合 ,蛋白质在确定的环境中 ,具有不同的嗜酸性和嗜硷性倾向 ,消灭着色差异易于观看。因此染液 PH 值对着色效果有影响。当呈淡灰色带纹不显时 ,应调整染液 pH 值 7.07.2,复染 10min,可获得鲜亮的显色效果。3、在采血接种培育是，不要参与太多的肝素。肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴细胞的转 化和分裂。但肝素量也不应太少，以免发生凝血或培育物中消灭纤维蛋白形成的膜状构造。这种膜状物一般在培育 24
15、小时左右消灭，此时可在无菌条件下将它除去以免影响培育效果。4、 在一般培育箱内培育时，必需将培育瓶口盖紧，以免培育液的PH 发生较大的变化。假设培育过程中，培育液酸化比较严峻培育液呈黄色时将不利于细胞生长，此时可参与适量无菌的 0.14%碳酸氢钠溶液调整或再参与 23ml 培育液来校正。培育箱的温度应把握在37+0.5，温度过高或过低都会影响细胞的生长。5、染色体标本质量不佳的缘由。假设淋巴细胞转化试验说明培育物生长发育良好，但制成的标本质量不佳时，其缘由可能为： 秋水仙素处理不当：一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有确定的关系，假设处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，假设处理时间太长，
16、则标本中的分裂细胞虽多， 但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不简洁观看。 低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早裂开，以致分裂细胞或染色体丧失；假设处理时间缺乏时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进展染色体计数分析。 离心速度不适宜：假设从培育瓶收集细胞后进展离心时的速度太低，细胞可能被丧失；假设细胞被低渗后离心速度过高，往往使分裂细胞过早裂开，分散良好的分裂相丧失， 以致制出的标本分裂相较少或大局部为剩余的分散不好的分裂相。 标本固定不充分：如固定液不颖，甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模糊、不分散，其四周有细胞浆的蓝色背景。 载玻片清洗不彻底：玻片有油迹，致使滴在
17、载玻片上的细胞悬液不能均匀分散，且细胞随液体流淌而丧失。 载玻片冷冻不够：适宜的冰湿玻片，从冰水中拿出时，其外表有一层霜雪。如冷冻不够则无此现象，此时细胞难以贴附在载玻片上。6、以下因素对染色体G 显带有确定的影响。（1） 胰蛋白酶溶液的浓度，是打算染色体消化时间的关键因素之一。浓度高时，消化时间短，但极易消化过，故一般消化时间不宜少于10 秒钟。（2） 胰蛋白酶溶液的温度：温度较高时，酶解反响速度较快。在有空调的试验室中，最 适宜的温度是室温。在进展显带之前，胰蛋白酶溶液应当在室温至少稳定30 分钟。对无空调控温的试验室，也有把胰蛋白酶溶液温度稳定在4的，有的甚至置冰箱中进展处理。在温度较低
18、的状况下，应当延特长理时间。如能把全部条件稳定下来， 则可得到全都的效果。（3） 胰蛋白酶溶液中的盐类成分：溶液中的二价阳离子会使反响减慢，但不能阻挡反响。（4） 制作标本的方法：火焰枯燥法制得的标本对胰蛋白酶处理的抵抗性较气干法标本要强些。（5） 标本的片龄：标本保存的时间越长，染色体对胰蛋白酶处理的抵抗性越大。片龄超过20 天以上的标本显带时，染色体往往呈斑点状，而不是显示带纹。（6） 染色：随着染色时间的延长，在染液外表会形成一层氧化膜发亮。染色完毕，应 把标本浸入水中洗去染液，或用自来水直接冲去染液。如直接倾去旧染液，这层氧化膜极易附着在标本片上形成污秽，且不易去除掉。用染色缸染色时，染色前应先用小片滤纸刮去液面的氧化层。另外，染液须现用现配，保存时间最好不超过48 小时， 旧染液染色效果不好。Giemsa 染液对 pH 极为敏感，pH 适宜才能获得好的效果，配制时需特别留意。（7） 在确定胰蛋白酶的处理时间时，可在同一标本片上用23 个时间段进展试消化，染色后在镜下观看。假设标本呈现蓝紫色与常规染色相像，说明胰蛋白酶的作用时间不够；假设染色体标本为桃红色，那就差不多了。（8） 当需要在同一标本上显示不同的带型如G 带和Q 带时，应领先作Q 显带，再作G 显带。