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1、第五章第五章 酶学分析技术酶学分析技术 退出退出 主要内容 六、工具酶及其临床应用六、工具酶及其临床应用一、酶的一般特征一、酶的一般特征 二、酶促反应动力学二、酶促反应动力学三、酶活性浓度测定技术三、酶活性浓度测定技术四、四、酶的免疫化学测定酶的免疫化学测定五、五、同工酶和亚型的测定同工酶和亚型的测定七、血清酶七、血清酶八、临床常用血清酶及其同工酶八、临床常用血清酶及其同工酶一、基本概念一、基本概念一、基本概念一、基本概念 第一节第一节 酶的一般特征酶的一般特征 三、酶的命名分类及编号三、酶的命名分类及编号 二、酶的结构与催化作用二、酶的结构与催化作用二、酶的结构与催化作用二、酶的结构与催化作
2、用 返回章返回章 1.1.1.1.酶、核酶。酶、核酶。酶、核酶。酶、核酶。2.2.2.2.酶酶酶酶的的的的催催催催化化化化特特特特性性性性：极极极极高高高高的的的的催催催催化化化化效效效效率率率率、高高高高度度度度的的的的特特特特异异异异性性性性、催化作用的可调节性。催化作用的可调节性。催化作用的可调节性。催化作用的可调节性。3.3.3.3.酶促反应：酶促反应：酶促反应：酶促反应：酶所催化的反应。酶所催化的反应。酶所催化的反应。酶所催化的反应。酶活性：酶活性：酶活性：酶活性：酶催化反应的能力。酶催化反应的能力。酶催化反应的能力。酶催化反应的能力。酶活性单位：酶活性单位：酶活性单位：酶活性单位：
3、在一定条件下使酶促反达到某一速在一定条件下使酶促反达到某一速在一定条件下使酶促反达到某一速在一定条件下使酶促反达到某一速度时所需要的酶量。度时所需要的酶量。度时所需要的酶量。度时所需要的酶量。底物底物底物底物(S)(S)(S)(S)：酶所作用的物质。酶所作用的物质。酶所作用的物质。酶所作用的物质。产物产物产物产物(P)(P)(P)(P)：酶促反应的生成物。酶促反应的生成物。酶促反应的生成物。酶促反应的生成物。酶的激活剂酶的激活剂酶的激活剂酶的激活剂:加速酶促反应的物质。加速酶促反应的物质。加速酶促反应的物质。加速酶促反应的物质。酶的抑制剂酶的抑制剂酶的抑制剂酶的抑制剂:减慢或终止酶促反应的物质
4、。减慢或终止酶促反应的物质。减慢或终止酶促反应的物质。减慢或终止酶促反应的物质。一、基本概念一、基本概念一、基本概念一、基本概念 返回节返回节 二、酶的结构与催化作用二、酶的结构与催化作用二、酶的结构与催化作用 单纯酶和结合酶单纯酶和结合酶单纯酶和结合酶单纯酶和结合酶 单纯酶：单纯酶：单纯酶：单纯酶：只含多肽链，是单纯蛋白质。只含多肽链，是单纯蛋白质。只含多肽链，是单纯蛋白质。只含多肽链，是单纯蛋白质。结合酶：结合酶：结合酶：结合酶：由酶蛋白和辅因子组成。由酶蛋白和辅因子组成。由酶蛋白和辅因子组成。由酶蛋白和辅因子组成。两者结合后形成的复合物称为全酶。两者结合后形成的复合物称为全酶。两者结合后
5、形成的复合物称为全酶。两者结合后形成的复合物称为全酶。与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。与酶蛋白结合牢固的称为辅基。与酶蛋白结合牢固的称为辅基。与酶蛋白结合牢固的称为辅基。与酶蛋白结合牢固的称为辅基。酶的活性中心酶的活性中心酶的活性中心酶的活性中心 酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域。一个特定区域。一个特定区域。一个特定区域。酶的催化作用机制酶的催化作用机制酶的催化
6、作用机制酶的催化作用机制 诱导契合学说。诱导契合学说。诱导契合学说。诱导契合学说。返回节返回节 三、酶的命名、分类及编号三、酶的命名、分类及编号三、酶的命名、分类及编号三、酶的命名、分类及编号 返回节返回节 一、米曼氏方程一、米曼氏方程一、米曼氏方程一、米曼氏方程 酶促反应动力学酶促反应动力学 三、酶促反应进程曲线三、酶促反应进程曲线 四、影响酶促反应的因素四、影响酶促反应的因素 二、二、二、二、KmKmKmKm与与与与Vmax Vmax Vmax Vmax 返回章返回章 n nMichaelis Michaelis Michaelis Michaelis 和和和和MentenMentenMe
7、ntenMenten提出的酶作用的中间产物学说提出的酶作用的中间产物学说提出的酶作用的中间产物学说提出的酶作用的中间产物学说:一、米曼氏方程一、米曼氏方程一、米曼氏方程一、米曼氏方程 E+SK1K2K3 返回节返回节 19131913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的 方程式，即米方程式，即米-曼氏方程曼氏方程(Michaelis-MentenMichaelis-Menten equation):equation):E+PES二、二、二、KmKmKm与与与Vmax Vmax Vmax KmKmKmKm值：值：值：值：等于酶促反应的初速率为最大速
8、率等于酶促反应的初速率为最大速率等于酶促反应的初速率为最大速率等于酶促反应的初速率为最大速率VmaxVmaxVmaxVmax一半一半一半一半 时的底物浓度，即时的底物浓度，即时的底物浓度，即时的底物浓度，即V V V VVmaxVmaxVmaxVmax时，则时，则时，则时，则KmKmKmKmSSSS。KmKmKmKm 在临床上的应用：在临床上的应用：在临床上的应用：在临床上的应用：反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最用来计算不同底
9、物浓度时酶促反应速度相当于最用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的百分率。大反应速度的百分率。大反应速度的百分率。大反应速度的百分率。根据根据根据根据KmKmKmKm值选择酶的最适底物。值选择酶的最适底物。值选择酶的最适底物。值选择酶的最适底物。确定工具酶用量。确定工具酶用量。确定工具酶用量。确定工具酶用量。确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依 据。据。据。据。VmaxVmaxVmaxVmax：酶完全被底物饱和时
10、的反应速度，代表了在一酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一 定酶量下的最大反应速率定酶量下的最大反应速率定酶量下的最大反应速率定酶量下的最大反应速率。返回节返回节 酶促反应时间进程曲线酶促反应时间进程曲线酶促反应时间进程曲线酶促反应时间进程曲线(S(S(S(S为底物，为底物，为底物，为底物，P P P P为产物为产物为产物为产物)三、酶促反应进程曲线三、酶促反应进程曲线三、酶促反应进程曲线 如如将将酶酶反反应应过过程程中中测测得得的的产产物物PP或或底底物物SS变变化化量量对对时时间间作作图图，可可得得酶酶促促
11、反反应应时间进程曲线。图中产物时间进程曲线。图中产物PP或底物或底物SS变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。延滞期延滞期线性反应期线性反应期底物耗尽期底物耗尽期必须根据线性反应期必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算的反应速率才能准确计算出酶活性浓度。出酶活性浓度。返回节返回节 四、影响酶促反应的因素四、影响酶促反应的因素四、影响酶促反应的因素 底物浓度对酶促反应的影响底物浓度对酶促反应的影响底物浓度对酶促反应的影响底物浓度对酶促反应的影响（1 1 1 1）当）当）当）当SKmSKmSKmSKm SKm SKm SKm时时时时，反应速率，反应速率，反应速率
12、，反应速率与底物浓度与底物浓度与底物浓度与底物浓度SSSS无关，无关，无关，无关，V V V VVmaxVmaxVmaxVmaxK EK EK EK E 称为称为称为称为零级反应零级反应零级反应零级反应，反应速率反应速率反应速率反应速率与酶浓度与酶浓度与酶浓度与酶浓度EEEE成正比成正比成正比成正比。酶学测。酶学测。酶学测。酶学测定时一般底物浓度可选择为定时一般底物浓度可选择为定时一般底物浓度可选择为定时一般底物浓度可选择为KmKmKmKm的的的的1010101020202020倍。倍。倍。倍。返回节返回节 常见酶温度转化系数常见酶温度转化系数 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的酶活性浓度测定就
13、是要使酶促反应的酶活性浓度测定就是要使酶促反应的酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度（初速度（初速度（初速度（v v v v）达到最大速度）达到最大速度）达到最大速度）达到最大速度VmaxVmaxVmaxVmax，即在过量，即在过量，即在过量，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应底物存在下的零级反应期的速度，此时反应底物存在下的零级反应期的速度，此时反应底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度速度与酶浓度速度与酶浓度速度与酶浓度EEEE之间存在线性关系。之间存在线性关系。之间存在线性关系。之间存在线性关系。第二节第二节 酶活性浓度测定技术酶活性浓度测定技术 一、酶活性浓度
14、测定方法一、酶活性浓度测定方法一、酶活性浓度测定方法一、酶活性浓度测定方法 二、酶偶联法二、酶偶联法二、酶偶联法二、酶偶联法 三、血清酶活性浓度测定条件的选择三、血清酶活性浓度测定条件的选择三、血清酶活性浓度测定条件的选择三、血清酶活性浓度测定条件的选择 四、酶活性浓度的单位四、酶活性浓度的单位四、酶活性浓度的单位四、酶活性浓度的单位 五、系数五、系数五、系数五、系数K K K K值的计算与应用值的计算与应用值的计算与应用值的计算与应用 六、临床酶学测定的标准化六、临床酶学测定的标准化六、临床酶学测定的标准化六、临床酶学测定的标准化 返回章返回章 1.1.1.1.按反应时间分类按反应时间分类按
15、反应时间分类按反应时间分类:定时法定时法定时法定时法 连续监测法连续监测法连续监测法连续监测法2.2.2.2.按检测方法分类按检测方法分类按检测方法分类按检测方法分类：量气法、分光光度法、荧光法量气法、分光光度法、荧光法量气法、分光光度法、荧光法量气法、分光光度法、荧光法 其它方法（其它方法（其它方法（其它方法（放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极谱法、谱法、谱法、谱法、HPLCHPLCHPLCHPLC或生物发光法等）。或生物发光法等）。或生物发光法等）。或生物发光法等）
16、。一、酶活性浓度测定方法一、酶活性浓度测定方法一、酶活性浓度测定方法一、酶活性浓度测定方法 返回节返回节 按检测方法分类按检测方法分类按检测方法分类按检测方法分类底物或产物浓度的检测底物或产物浓度的检测底物或产物浓度的检测底物或产物浓度的检测 返回节返回节 定时法（固定时间法）定时法（固定时间法）定时法（固定时间法）定时法（固定时间法）测测测测定定定定酶酶酶酶与与与与底底底底物物物物作作作作用用用用反反反反应应应应一一一一定定定定时时时时间间间间后后后后底底底底物物物物或或或或产产产产物物物物变变变变化化化化的总量，计算酶促反应平均速度。的总量，计算酶促反应平均速度。的总量，计算酶促反应平均速
17、度。的总量，计算酶促反应平均速度。优优优优点点点点：比比比比较较较较简简简简单单单单，最最最最后后后后测测测测定定定定时时时时因因因因酶酶酶酶促促促促反反反反应应应应已已已已被被被被终终终终止止止止，故故故故所所所所用用用用仪仪仪仪器器器器无无无无需需需需恒恒恒恒温温温温装装装装置置置置，显显显显色色色色剂剂剂剂的的的的选选选选择择择择也也也也可可可可不不不不考考考考虑虑虑虑对酶活性的影响。对酶活性的影响。对酶活性的影响。对酶活性的影响。缺缺缺缺点点点点：无无无无法法法法知知知知道道道道在在在在整整整整个个个个酶酶酶酶促促促促反反反反应应应应进进进进程程程程中中中中是是是是否否否否都都都都处处
18、处处于于于于线线线线性期。性期。性期。性期。利利利利用用用用该该该该法法法法测测测测定定定定酶酶酶酶活活活活性性性性浓浓浓浓度度度度，必必必必须须须须保保保保证证证证酶酶酶酶和和和和底底底底物物物物在在在在所所所所选选选选定定定定的的的的温温温温度度度度下下下下作作作作用用用用时时时时间间间间要要要要非非非非常常常常精精精精确确确确，否否否否则则则则会会会会引引引引起起起起较较较较大大大大误误误误差。差。差。差。返回节返回节 连续监测法连续监测法连续监测法连续监测法 又又又又称称称称速速速速率率率率法法法法或或或或动动动动力力力力学学学学法法法法，指指指指在在在在酶酶酶酶促促促促反反反反应应应
19、应过过过过程程程程中中中中用用用用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间 的的的的变变变变化化化化量量量量，求求求求出出出出酶酶酶酶反反反反应应应应初初初初速速速速度度度度，间间间间接接接接计计计计算算算算酶酶酶酶活活活活 性性性性浓浓浓浓度的方法。度的方法。度的方法。度的方法。优点：优点：优点：优点：无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，就反应物变化的多点测定
20、结果连接成线，观察就反应物变化的多点测定结果连接成线，观察就反应物变化的多点测定结果连接成线，观察就反应物变化的多点测定结果连接成线，观察 到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活 性，结果准确可靠。性，结果准确可靠。性，结果准确可靠。性，结果准确可靠。要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自动生化分析仪都能达到这些要求。动生化分析仪都能达到这些要求
21、。动生化分析仪都能达到这些要求。动生化分析仪都能达到这些要求。返回节返回节 连续监测法的种类连续监测法的种类 直接法直接法 是是指指待待测测酶酶酶酶促促反反应应的的底底物物或或产产物物有有特特征征性性的的理理化化性性质质，然后通过特殊的仪器直接检测。然后通过特殊的仪器直接检测。u基于基于NADHNADH或或NADPHNADPH的反应原理的反应原理 ：LDLD、-HBD-HBD等等u基于人工合成色素原底物基于人工合成色素原底物 ：ALP ALP、GGTGGT、AMSAMS等等 u基于氧的消耗基于氧的消耗 ：各种氧化酶：各种氧化酶 间接法间接法 是是指指酶酶促促反反应应底底物物和和产产物物之之间间
22、没没有有特特征征性性的的理理化化性性质质，需需通通过过另另一一个个化化学学反反应应或或生生化化反反应应，将将底底物物或或产产物物转转化化为为有有明明显显特特征征理理化化性性质质的的另另一一个个化化合合物物。用用直直接接法法来来测测定定的的酶酶类类非常有限，很多情况下不得不使用间接法。非常有限，很多情况下不得不使用间接法。l化学法化学法：如如ChEChE的丁酰硫代胆碱测定法。的丁酰硫代胆碱测定法。l酶偶联法酶偶联法 返回节返回节 用用用用自自自自动动动动生生生生化化化化分分分分析析析析仪仪仪仪测测测测定定定定同同同同一一一一酶酶酶酶，条条条条件件件件固固固固定定定定时时时时，从从从从理理理理论论
23、论论上上上上来来来来讲讲讲讲V V V V、v v v v和和和和L L L L均为固定值，均为固定值，均为固定值，均为固定值，为常数，则将公式为常数，则将公式为常数，则将公式为常数，则将公式 简化为简化为简化为简化为 如如如如LDLDLDLD活活活活性性性性浓浓浓浓度度度度，已已已已知知知知NADHNADHNADHNADH的的的的 为为为为6.226.226.226.22 101010103 3 3 3cmcmcmcm-1-1-1-1.mol.mol.mol.mol-1-1-1-1，血血血血清量为清量为清量为清量为50505050 l l l l，底物液为，底物液为，底物液为，底物液为1ml
24、1ml1ml1ml，比色杯光径为，比色杯光径为，比色杯光径为，比色杯光径为1cm1cm1cm1cm，则，则，则，则 F=1.05F=1.05F=1.05F=1.05 101010106 6 6 6/6.22/6.22/6.22/6.22 10 10 10 103 3 3 3 0.050.050.050.05 1=33761=33761=33761=3376五、系数五、系数五、系数五、系数K K K K值的计算与应用值的计算与应用值的计算与应用值的计算与应用 返回节返回节 连续监测法中常数连续监测法中常数连续监测法中常数连续监测法中常数K K K K值的设置值的设置值的设置值的设置 测定酶的判断
25、值或参考范围上限测定酶的判断值或参考范围上限测定酶的判断值或参考范围上限测定酶的判断值或参考范围上限，保证测定的可靠，所，保证测定的可靠，所，保证测定的可靠，所，保证测定的可靠，所 以转氨酶的常数以转氨酶的常数以转氨酶的常数以转氨酶的常数K K K K一般在一般在一般在一般在3000300030003000左右，不少人宁愿在左右，不少人宁愿在左右，不少人宁愿在左右，不少人宁愿在1500150015001500 左右。左右。左右。左右。应考虑到测定时间，应考虑到测定时间，应考虑到测定时间，应考虑到测定时间，测定时间短到测定时间短到测定时间短到测定时间短到0.50.50.50.5分，此时分，此时分
26、，此时分，此时0.0010.0010.0010.001嗓嗓嗓嗓 音对每分钟音对每分钟音对每分钟音对每分钟AAAA误差将是误差将是误差将是误差将是0.0020.0020.0020.002，反之，测定时间延长，反之，测定时间延长，反之，测定时间延长，反之，测定时间延长 到到到到2 2 2 2分钟，误差也小一半。即测定时间长，则分钟，误差也小一半。即测定时间长，则分钟，误差也小一半。即测定时间长，则分钟，误差也小一半。即测定时间长，则K K K K值可以值可以值可以值可以 设置大一些，如测定时间只有设置大一些，如测定时间只有设置大一些，如测定时间只有设置大一些，如测定时间只有0.50.50.50.5
27、分钟，分钟，分钟，分钟，K K K K值一般不超值一般不超值一般不超值一般不超 过过过过4000400040004000。改变改变改变改变K K K K值最方便的途径值最方便的途径值最方便的途径值最方便的途径就是改变标本稀释度，稀释倍数就是改变标本稀释度，稀释倍数就是改变标本稀释度，稀释倍数就是改变标本稀释度，稀释倍数 愈大，愈大，愈大，愈大，K K K K值愈大。值愈大。值愈大。值愈大。返回节返回节 第七节第七节 工具酶及其临床应用工具酶及其临床应用 一、工具酶一、工具酶一、工具酶一、工具酶 二、代谢物的酶法测定二、代谢物的酶法测定二、代谢物的酶法测定二、代谢物的酶法测定 返回章返回章 概念
28、概念概念概念 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。的酶称为工具酶。的酶称为工具酶。的酶称为工具酶。工具酶参与的指示反应工具酶参与的指示反应工具酶参与的指示反应工具酶参与的指示反应 偶联偶联偶联偶联H H H H2 2 2 2O O O O2 2 2 2工具酶及指示反应：工具酶及指示反应：工具酶及指示反应：工具酶及指示反应：如常用的如常用的如常用的如常用的TrinderTrinderTrinderTrinder反应。反应。反应。反应。NAD(P)+NAD(P)+NAD(P)+NAD
29、(P)+或或或或NAD(P)HNAD(P)HNAD(P)HNAD(P)H偶联的脱氢酶及其指偶联的脱氢酶及其指偶联的脱氢酶及其指偶联的脱氢酶及其指示反应：示反应：示反应：示反应：利用氧化利用氧化利用氧化利用氧化-还原酶反应使其连接到还原酶反应使其连接到还原酶反应使其连接到还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)HNAD(P)-NAD(P)HNAD(P)-NAD(P)HNAD(P)-NAD(P)H的正的正的正的正/逆反应后，直接测定逆反应后，直接测定逆反应后，直接测定逆反应后，直接测定NAD(P)HNAD(P)HNAD(P)HNAD(P)H的变化量。的变化量。的变化量。的变化量。一、工具酶一
30、、工具酶一、工具酶一、工具酶 返回节返回节 工具酶的其他应用工具酶的其他应用工具酶的其他应用工具酶的其他应用n n酶循环法酶循环法酶循环法酶循环法n n固相酶固相酶固相酶固相酶酶循环法测定胆汁酸酶循环法测定胆汁酸 返回节返回节 多酶体系中酶促偶联反应分析多酶体系中酶促偶联反应分析多酶体系中酶促偶联反应分析多酶体系中酶促偶联反应分析 二、代谢物的酶法测定二、代谢物的酶法测定二、代谢物的酶法测定 终点法终点法终点法终点法概念：概念：概念：概念：在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐在代谢
31、物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反减少而产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反减少而产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反减少而产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反应趋于平衡，测定反应完全后待测物或产物变化的总量，即终应趋于平衡，测定反应完全后待测物或产物变化的总量，即终应趋于平衡，测定反应完全后待测物或产物变化的总量，即终应趋于平衡，测定反应完全后待测物或产物变化的总量，即终点法（又称平衡法）。点法（又称平衡法）。点法（又称平衡法）。点法（又称平衡法）。测定的基本条件：测定的基本条件：测定的基本条
32、件：测定的基本条件：待测物浓度待测物浓度待测物浓度待测物浓度SSSS应远小于其米氏常数应远小于其米氏常数应远小于其米氏常数应远小于其米氏常数KmKmKmKm，此时任何时刻的，此时任何时刻的，此时任何时刻的，此时任何时刻的反应速度反应速度反应速度反应速度 v=VS/Km v=VS/Km v=VS/Km v=VS/Km，呈一级反应。，呈一级反应。，呈一级反应。，呈一级反应。反应配方中所用酶量（反应配方中所用酶量（反应配方中所用酶量（反应配方中所用酶量（V V V V）应足够大，而）应足够大，而）应足够大，而）应足够大，而KmKmKmKm应小，以保证应小，以保证应小，以保证应小，以保证有较快的反应速
33、度完成测定。有较快的反应速度完成测定。有较快的反应速度完成测定。有较快的反应速度完成测定。返回节返回节 直接法直接法直接法直接法 待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差异，这种是最简单的代谢物浓度测定方法。异，这种是最简单的代谢物浓度测定方法。异，这种是最简单的代谢物浓度测定方法。异，这种是最简单的代谢物浓度测定方法。如尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在如尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在如尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在如尿酸在尿酸氧化酶作用下生成
34、的尿囊素在293nm293nm293nm293nm有有有有特异的吸收峰，胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿特异的吸收峰，胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿特异的吸收峰，胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿特异的吸收峰，胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿素造成素造成素造成素造成450nm450nm450nm450nm处的吸光度下降等。体内还有很多代谢物可处的吸光度下降等。体内还有很多代谢物可处的吸光度下降等。体内还有很多代谢物可处的吸光度下降等。体内还有很多代谢物可以直接测定，关键是需要相对应的酶。以直接测定，关键是需要相对应的酶。以直接测定，关键是需要相对应的酶。以直接测定，关键是需要相对应的酶
35、。代谢物的酶法测定代谢物的酶法测定代谢物的酶法测定代谢物的酶法测定终点法的类型终点法的类型终点法的类型终点法的类型 返回节返回节 酶偶联法酶偶联法酶偶联法酶偶联法 与酶活性测定一样，直接法测定的项目是有限与酶活性测定一样，直接法测定的项目是有限与酶活性测定一样，直接法测定的项目是有限与酶活性测定一样，直接法测定的项目是有限的。每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测的。每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测的。每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测的。每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测方法。方法。方法。方法。如甘油三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指示反如甘油三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指
36、示反如甘油三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指示反如甘油三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指示反应主要分两大类：应主要分两大类：应主要分两大类：应主要分两大类：NADNADNADNAD（P P P P）H H H H和过氧化物酶（和过氧化物酶（和过氧化物酶（和过氧化物酶（PODPODPODPOD）系）系）系）系统。统。统。统。代谢物的酶法测定代谢物的酶法测定代谢物的酶法测定代谢物的酶法测定终点法的类型终点法的类型终点法的类型终点法的类型 返回节返回节 Ex Ex Ex Ex 为待测酶，为待测酶，为待测酶，为待测酶，A A A A为底物，为底物，为底物，为底物，B B B B为中间产物。为中间产物。为中间产
37、物。为中间产物。A A A A、B B B B二物质的变二物质的变二物质的变二物质的变化无法直接监测，此时可外加第二个酶化无法直接监测，此时可外加第二个酶化无法直接监测，此时可外加第二个酶化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei(Ei(Ei(Ei(为指示酶为指示酶为指示酶为指示酶)，其，其，其，其底物为底物为底物为底物为B B B B，反应产物为，反应产物为，反应产物为，反应产物为P P P P可直接测定。可直接测定。可直接测定。可直接测定。二、酶偶联法二、酶偶联法二、酶偶联法二、酶偶联法 返回节返回节 酶偶联反应酶偶联反应酶偶联反应酶偶联反应 最简单的模式为：最简单的模式为：最简单的模式为：最
38、简单的模式为：辅辅辅辅助助助助反反反反应应应应 如如如如果果果果一一一一些些些些酶酶酶酶促促促促反反反反应应应应找找找找不不不不到到到到合合合合适适适适的的的的指指指指示示示示酶酶酶酶与与与与其其其其直直直直接接接接偶偶偶偶联联联联，此此此此时时时时还还还还可可可可在在在在始始始始发发发发反反反反应应应应和和和和指指指指示示示示反反反反应应应应之之之之间间间间加加加加入入入入另另另另一一一一种种种种酶酶酶酶，将将将将二二二二者者者者连连连连在在在在一一一一起起起起，此此此此反反反反应应应应称称称称为为为为辅辅辅辅助助助助反反反反应应应应。模模模模式为：式为：式为：式为：返回节返回节 其中，其中
39、，其中，其中，B B B B、C C C C均为中间产物，均为中间产物，均为中间产物，均为中间产物，EaEaEaEa、EiEiEiEi都为工具酶。都为工具酶。都为工具酶。都为工具酶。最后最后最后最后一个酶称指示酶一个酶称指示酶一个酶称指示酶一个酶称指示酶EiEiEiEi，其他外加的酶都为辅助酶（，其他外加的酶都为辅助酶（，其他外加的酶都为辅助酶（，其他外加的酶都为辅助酶（EaEaEaEa）。）。）。）。酶偶联反应原理酶偶联反应原理酶偶联反应原理酶偶联反应原理 (1)(1)(1)(1)当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存在几个当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存在几个当用酶偶联法测定时，在偶联反应中
40、存在几个当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存在几个时期：时期：时期：时期：预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期。(2)(2)(2)(2)延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢且不稳定，称为延滞期。在这期间
41、指示酶反应速度且不稳定，称为延滞期。在这期间指示酶反应速度且不稳定，称为延滞期。在这期间指示酶反应速度且不稳定，称为延滞期。在这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。不能代表测定酶量多少。不能代表测定酶量多少。不能代表测定酶量多少。(3)(3)(3)(3)设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短越设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短越设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短越设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短越好，测定时间要避开此期。好，测定时间要避开此期。好，测定时间要避开此期。好，测定时间要避开此期。返回节返回节 对酶偶联反应的要求对酶偶联反应的要求对酶偶联反应的要求对酶偶联反应的要求
42、 指示酶反应必须是一级反应指示酶反应必须是一级反应指示酶反应必须是一级反应指示酶反应必须是一级反应 酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转变为最中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转变为最中间产物浓度很低
43、的条件下进行，并且将此很快转变为最中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。工具酶工具酶工具酶工具酶 作作作作为为为为试试试试剂剂剂剂用用用用于于于于测测测测定定定定化化化化合合合合物物物物浓浓浓浓度度度度或或或或酶酶酶酶活活活活性性性性的的的的酶酶酶酶称称称称为为为为工工工工具具具具酶。酶。酶。酶。返回节返回节 酶偶联法测定酶偶联法测定ALTALT的吸光度变化图的吸光度变化图 返
44、回节返回节 动力学法动力学法动力学法动力学法概念：概念：概念：概念：根据米氏方程，当根据米氏方程，当根据米氏方程，当根据米氏方程，当SKmSKmSKmSKm，一般，一般，一般，一般S/Km0.2S/Km0.2S/Km0.2S/Km0.2，最好，最好，最好，最好0.050.050.050.05，S+KmKmS+KmKmS+KmKmS+KmKm，此时呈一级反应，反应初速，此时呈一级反应，反应初速，此时呈一级反应，反应初速，此时呈一级反应，反应初速度度度度v=kSv=kSv=kSv=kS。如果能准确测定反应的初速度（。如果能准确测定反应的初速度（。如果能准确测定反应的初速度（。如果能准确测定反应的初
45、速度（v v v v），采用标），采用标），采用标），采用标准浓度对照法即可求得待测物的浓度。准浓度对照法即可求得待测物的浓度。准浓度对照法即可求得待测物的浓度。准浓度对照法即可求得待测物的浓度。实际操作中，测定两个固定时间的吸光度差值，只实际操作中，测定两个固定时间的吸光度差值，只实际操作中，测定两个固定时间的吸光度差值，只实际操作中，测定两个固定时间的吸光度差值，只要此期间待测物消耗要此期间待测物消耗要此期间待测物消耗要此期间待测物消耗5%5%5%5%，就可以采用标准浓度对照法计，就可以采用标准浓度对照法计，就可以采用标准浓度对照法计，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度，所以动力学法有时
46、又称为定时法。算样本浓度，所以动力学法有时又称为定时法。算样本浓度，所以动力学法有时又称为定时法。算样本浓度，所以动力学法有时又称为定时法。返回节返回节 与终点法相比，动态法与终点法相比，动态法与终点法相比，动态法与终点法相比，动态法测定中待测物无需完全转化，故工具酶测定中待测物无需完全转化，故工具酶测定中待测物无需完全转化，故工具酶测定中待测物无需完全转化，故工具酶的用量较少，为了保证有足够的测定线性，所用酶的的用量较少，为了保证有足够的测定线性，所用酶的的用量较少，为了保证有足够的测定线性，所用酶的的用量较少，为了保证有足够的测定线性，所用酶的KmKmKmKm应足够应足够应足够应足够大。大
47、。大。大。两者对于测定仪器的要求不同两者对于测定仪器的要求不同两者对于测定仪器的要求不同两者对于测定仪器的要求不同。终点法测定对于仪器的电噪声。终点法测定对于仪器的电噪声。终点法测定对于仪器的电噪声。终点法测定对于仪器的电噪声和温控要求不严，而动态法要求仪器的电噪声小，吸光度应读和温控要求不严，而动态法要求仪器的电噪声小，吸光度应读和温控要求不严，而动态法要求仪器的电噪声小，吸光度应读和温控要求不严，而动态法要求仪器的电噪声小，吸光度应读准到准到准到准到0.00010.00010.00010.0001，温度变化，温度变化，温度变化，温度变化0.1%0.1%0.1%20ULN)(20ULN)(2
48、0ULN)(20ULN)的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。返回节返回节 二、二、二、-谷氨酰转移酶及其同工酶谷氨酰转移酶及其同工酶谷氨酰转移酶及其同工酶 生化特性生化特性生化特性生化特性 -GT-GT-GT-GT或或或或GGT GGT GGT GGT 是一种含巯基的线粒体酶。是一种含巯基的线粒体酶。是一种含巯基的线粒体酶。是一种含巯基的线粒体酶。组织分布组织分布组织分布组织分布 分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组
49、织分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织中，其中以肾脏含量最多。中，其中以肾脏含量最多。中，其中以肾脏含量最多。中，其中以肾脏含量最多。GGT GGT GGT GGT在细胞中有膜结合型（疏水型）和可溶型（亲在细胞中有膜结合型（疏水型）和可溶型（亲在细胞中有膜结合型（疏水型）和可溶型（亲在细胞中有膜结合型（疏水型）和可溶型（亲水型）两种。水型）两种。水型）两种。水型）两种。血清中血清中血清中血清中GGTGGTGGTGGT主要来源于肝胆系统。主要来源于肝胆系统。主要来源于肝胆系统。主要来源于肝胆系统。返回节返回节 GGTGGTGGTGGT的测定方法的测定方法的测定方法的测定方法 以以以以往往往
50、往国国国国内内内内多多多多以以以以L-L-L-L-谷谷谷谷氨氨氨氨酰酰酰酰-萘萘萘萘胺胺胺胺或或或或L-L-L-L-谷谷谷谷氨氨氨氨酰酰酰酰-对对对对硝硝硝硝基基基基苯苯苯苯胺胺胺胺等等等等人人人人工工工工合合合合成成成成底底底底物物物物进进进进行行行行比比比比色色色色法法法法测测测测定定定定（即即即即重重重重氮氮氮氮试试试试剂剂剂剂法法法法）。由由由由于于于于底底底底物物物物水水水水溶溶溶溶性性性性差差差差，缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液和和和和 pH pH pH pH 对对对对结结结结果果果果影影影影响响响响较较较较大大大大，现现现现已已已已较较较较少少少少应应应应用用用用。目目目目前前前前国国