《酶学基础》PPT课件.ppt

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1、v学习目的学习目的l了解酶与酶工程的意义了解酶与酶工程的意义l掌握酶的分类、催化调节特性及作用机制掌握酶的分类、催化调节特性及作用机制l明确酶工程的概念明确酶工程的概念l熟悉大规模纯化酶技术的原理及应用熟悉大规模纯化酶技术的原理及应用第一章第一章 酶学与酶工程酶学与酶工程基础篇基础篇 孙利芹孙利芹2011v1.1 1.1 概述概述v1.2 1.2 酶的组成与结构特点酶的组成与结构特点v1.3 1.3 酶的作用机制酶的作用机制v1.4 1.4 酶的催化作用动力学酶的催化作用动力学v1.5 pH1.5 pH和温度对酶催化反应速度的影响和温度对酶催化反应速度的影响v1.6 1.6 酶的分离纯化酶的分

2、离纯化 孙利芹孙利芹20111.1 概述概述一、酶与酶工程研究的意义一、酶与酶工程研究的意义l研究酶的理化性质与作用机理对于阐明生命现象的本质研究酶的理化性质与作用机理对于阐明生命现象的本质具有重要意义；具有重要意义；l分子生物学研究的重要工具分子生物学研究的重要工具l酶工程作为生物技术的一个重要分支，在食品、酶工程作为生物技术的一个重要分支，在食品、饲料、饲料、纺织、洗涤剂、医药和环保等行业发挥重要作用纺织、洗涤剂、医药和环保等行业发挥重要作用 孙利芹孙利芹2011二、酶学研究简史二、酶学研究简史1.酶的定义酶的定义 酶是具有生物催化功能的生物大分子酶是具有生物催化功能的生物大分子2.发展历

3、史发展历史 国内：国内：（1 1）40004000多年前的夏禹时代酿酒盛行多年前的夏禹时代酿酒盛行 （2 2）公元十世纪左右，我国已利用豆类作酱）公元十世纪左右，我国已利用豆类作酱 （3 3）约）约30003000年前，人们利用麦曲淀粉酶将淀粉降解为年前，人们利用麦曲淀粉酶将淀粉降解为 麦芽糖制造饴糖麦芽糖制造饴糖 孙利芹孙利芹2011v1833年年 淀粉酶淀粉酶 佩恩（佩恩（Payen）和帕索兹（）和帕索兹（Persoz）从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀）从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一种可使淀粉水解生成可溶性糖的物质得到一种可使淀粉水解生成可溶性糖的物质淀粉酶制剂淀粉酶制剂(diastase

4、)v1878年年 ENZYME-in yeast 库尼（库尼（Kunne）首次将酵母中进行酒精发酵的物质称为酶）首次将酵母中进行酒精发酵的物质称为酶Enzyme，这个词来自希腊文，其意思是，这个词来自希腊文，其意思是“在酵母中在酵母中”(In Yeast)v18961896年，德国年，德国BuchnerBuchner兄弟发现酶的理化性质，开始了酶学的研究。兄弟发现酶的理化性质，开始了酶学的研究。v19021902年中间产物学说；年中间产物学说；19131913年，米氏方程年，米氏方程v1926年年 酶的化学本质为蛋白质酶的化学本质为蛋白质 萨姆纳（萨姆纳（Sumner）首次从刀豆提取液中分离纯

5、化得到脲酶结晶，并）首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质，提出酶的化学本质是蛋白质的观点。获证明它具有蛋白质的性质，提出酶的化学本质是蛋白质的观点。获19471947诺贝尔奖。诺贝尔奖。孙利芹孙利芹2011*1960年年 操纵子学说操纵子学说 雅各（雅各（Jacob）和莫诺德（）和莫诺德（Monod）提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的调）提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制。节机制。*1963年年 酶的一级结构；酶的一级结构；*1965年年 酶的空间结构；酶的空间结构；*1969年年 酶的人工合成；酶的人工合成；*1982年年 核酸酶的发现核酸酶的发现*198

6、3年年 核酸酶的确认核酸酶的确认 切切克克(Thomas(Thomas Cech)Cech)等等人人发发现现四四膜膜虫虫（TetrahynenaTetrahynena）细细胞胞的的26S 26S rRNArRNA前前体体在在完完全全没没有有蛋蛋白白质质存存在在的的情情况况下下自自我我加加工工，催催化化得得到到成成熟熟的的rRNArRNA，说说明明RNARNA本本身身是是生生物物催催化化剂剂，称称其其为为“Ribozyme”,“Ribozyme”,对对酶酶的的传统概念提出了严峻的挑战传统概念提出了严峻的挑战理论研究进展理论研究进展 孙利芹孙利芹2011应用研究进展应用研究进展v19171917年

7、，法国人用枯草杆菌产生的淀粉酶作纺织工年，法国人用枯草杆菌产生的淀粉酶作纺织工 业上的退浆剂业上的退浆剂v19491949年，日本采用深层培养法生产年，日本采用深层培养法生产-淀粉酶获得成淀粉酶获得成功功v19591959年，日本应用葡萄糖淀粉酶催化淀粉生产葡萄年，日本应用葡萄糖淀粉酶催化淀粉生产葡萄糖，使糖得率糖，使糖得率80%80%增加到增加到100%100%v7070年代后，固定化酶技术发展年代后，固定化酶技术发展促进酶工程的发展促进酶工程的发展1969年日本千烟一朗首先在工业上应用固定化氨基酰化年日本千烟一朗首先在工业上应用固定化氨基酰化酶拆分酶拆分DL-氨基酸获得成功氨基酸获得成功

8、孙利芹孙利芹2011三、酶工程简介三、酶工程简介1.1.酶工程的概念及研究领域酶工程的概念及研究领域 酶工程（酶工程（enzyme engineering)enzyme engineering)是是生物工程的主要内容之生物工程的主要内容之一，是一，是酶学和工程学酶学和工程学相互渗透结合发展而成的一门新技术学科，相互渗透结合发展而成的一门新技术学科，是酶学、是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的交叉科学技术。它是交叉科学技术。它是从应用的目的出发从应用的目的出发研究酶，是在一定生物研究酶，是在一定生物反应装置中利用酶的催化性质将相应原料转

9、化为有用物质的技反应装置中利用酶的催化性质将相应原料转化为有用物质的技术。术。目前已经在自然界发现并鉴定的酶大约有目前已经在自然界发现并鉴定的酶大约有80008000种种，广泛应，广泛应用到工农业生产和科学研究种的只有用到工农业生产和科学研究种的只有800800种种，使用受到限制的，使用受到限制的原因：原因：a a不稳定；不稳定；b b分离纯化工艺复杂；分离纯化工艺复杂；c c酶制剂成本高。酶制剂成本高。根据研究和解决上述问题的手段，将酶工程分为：根据研究和解决上述问题的手段，将酶工程分为：孙利芹孙利芹2011v化学酶工程化学酶工程：由酶学与化学工程技术相结合而成，由酶学与化学工程技术相结合而

10、成，主要通过化学修饰、固定化处理、甚至化学合成等主要通过化学修饰、固定化处理、甚至化学合成等手段改变酶的性质以提高催化效率和降低成本。一手段改变酶的性质以提高催化效率和降低成本。一般包括：天然酶、化学修饰酶、般包括：天然酶、化学修饰酶、固定化酶和化学人固定化酶和化学人工酶的研究应用。工酶的研究应用。v生物酶工程生物酶工程：是以酶学和基因重组技术为主旨与现是以酶学和基因重组技术为主旨与现代分子生物技术相结合的产物，主要包括：代分子生物技术相结合的产物，主要包括：a a 用基用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）；因工程技术大量生产酶（克隆酶）；b b修饰酶基因产修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）生遗

11、传修饰酶（突变酶）c c 设计新的酶基因合成自设计新的酶基因合成自然界不曾有的新酶。然界不曾有的新酶。孙利芹孙利芹20112.2.酶工程的发展史酶工程的发展史v二战后，二战后，2020世纪世纪5050年代开始，由微生物发酵液中分离出一些年代开始，由微生物发酵液中分离出一些酶，制成酶制剂。酶，制成酶制剂。v6060年代后，固定化酶、固定化细胞技术发展，使酶制剂的应年代后，固定化酶、固定化细胞技术发展，使酶制剂的应用呈现新的面貌。用呈现新的面貌。19691969年，日本千烟一郎首先用固定化酶技年，日本千烟一郎首先用固定化酶技术成功拆分术成功拆分DL-aaDL-aav19711971年，第一次国际酶

12、工程会议在年，第一次国际酶工程会议在HennileerHennileer召开，肯定了召开，肯定了固定化酶技术的应用固定化酶技术的应用v19831983年第年第7 7届国际酶工程会议提出了酶分子的修饰和改造届国际酶工程会议提出了酶分子的修饰和改造v酶生物反应器的研究，出现酶膜反应器、免疫传感器、多酶酶生物反应器的研究，出现酶膜反应器、免疫传感器、多酶反应器等反应器等v酶抑制剂的研究，在代谢控制、生物农药、生物除草剂等方酶抑制剂的研究，在代谢控制、生物农药、生物除草剂等方面发挥作用面发挥作用v基因工程表达的酶、经分子改造和修饰的酶；模拟酶、抗体基因工程表达的酶、经分子改造和修饰的酶；模拟酶、抗体酶

13、、杂交酶、非水相酶反应技术等是今后研究的热点酶、杂交酶、非水相酶反应技术等是今后研究的热点 孙利芹孙利芹2011一、蛋白酶的结构特点一、蛋白酶的结构特点u一级结构一级结构 蛋白质的肽链的蛋白质的肽链的化学结构，即通过化学结构，即通过肽键连接起来的氨肽键连接起来的氨基酸残基的数量、基酸残基的数量、种类和顺序种类和顺序1.2 酶的组成与结构特点酶的组成与结构特点 孙利芹孙利芹2011v二级结构二级结构 一级结构中相近的氨基酸残基键由氢键相互作用形成的带一级结构中相近的氨基酸残基键由氢键相互作用形成的带有有-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角、无规则卷曲等细微结构。转角、无规则卷曲等细微结构。-螺旋：

14、螺旋：由蛋白质的肽链环绕中心轴有规则的一圈一圈由蛋白质的肽链环绕中心轴有规则的一圈一圈盘旋而成的螺旋状构象。典型的盘旋而成的螺旋状构象。典型的-螺旋螺距螺旋螺距5.4A5.4A0 0，平均，平均含有含有3.63.6个氨基酸残基。个氨基酸残基。-折叠：折叠：由两条或多条肽链充分伸展成锯齿状的折叠结由两条或多条肽链充分伸展成锯齿状的折叠结构，通过侧向聚集形成与肽链长轴方向平行的折扇状构象，构，通过侧向聚集形成与肽链长轴方向平行的折扇状构象，其稳定性靠氢键维持。其稳定性靠氢键维持。-转角：转角：是球状蛋白分子中发现的一种肽链主链构象，是球状蛋白分子中发现的一种肽链主链构象，肽链盘绕折叠结构往往发生在

15、肽链盘绕折叠结构往往发生在180180度的急转弯，从而产生度的急转弯，从而产生-转角转角 无规则卷曲：无规则卷曲：肽链的主链不规则、多向性的随机盘曲所形肽链的主链不规则、多向性的随机盘曲所形成的构象成的构象 孙利芹孙利芹2011v螺旋结构模型螺旋结构模型 孙利芹孙利芹2011螺旋结构模型螺旋结构模型 孙利芹孙利芹2011片状结构模型片状结构模型 孙利芹孙利芹2011 孙利芹孙利芹2011转角结构转角结构 孙利芹孙利芹2011无规则卷曲无规则卷曲 孙利芹孙利芹2011v三级结构三级结构 螺旋状卷曲的多肽链通过氨螺旋状卷曲的多肽链通过氨基酸侧链之间的相互作用力基酸侧链之间的相互作用力进一步折叠而成

16、的立体结构。进一步折叠而成的立体结构。部分蛋白质形成三级结构部分蛋白质形成三级结构后就表现出生物活性了。后就表现出生物活性了。v溶菌酶的三级结构溶菌酶的三级结构 孙利芹孙利芹2011磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构 孙利芹孙利芹2011v四级结构四级结构 寡聚蛋白中亚基的数目、寡聚蛋白中亚基的数目、种类和各亚基的空间种类和各亚基的空间排布及相互作用等。排布及相互作用等。每个亚基一般就是一每个亚基一般就是一条多肽链，亚基间有条多肽链，亚基间有非共价键维系在一起，非共价键维系在一起，包括：氢键、包括：氢键、静电引静电引力、力、范德华力和疏水范德华力和疏水相互

17、作用相互作用 孙利芹孙利芹2011Structure of yeast Acetohydroxyacid synthase 孙利芹孙利芹2011酶酶(蛋白质蛋白质)各级结构的关系各级结构的关系 孙利芹孙利芹2011二、酶的组成二、酶的组成v单体酶：单体酶：只有三级结构，没有四级结构。种类很少，一般为只有三级结构，没有四级结构。种类很少，一般为 水解酶类，如牛胰核糖核酸酶是由水解酶类，如牛胰核糖核酸酶是由124个氨基酸残个氨基酸残 基组成的一条肽链；鸡卵清溶菌酶有基组成的一条肽链；鸡卵清溶菌酶有129个个aa组成组成v 寡聚酶：寡聚酶：有两个或两个以上亚基组成的酶，即具有四级结构有两个或两个以上

18、亚基组成的酶，即具有四级结构 的酶。如的酶。如E.coli的的RNA聚合酶由聚合酶由亚基亚基 组成。组成。v多酶复合体：多酶复合体：几种酶彼此嵌合形成一个复合体。在新陈代谢几种酶彼此嵌合形成一个复合体。在新陈代谢 过程中的某一反应链中起作用，如脂肪酸合成过程中的某一反应链中起作用，如脂肪酸合成 中的脂肪酸合成酶复合体。中的脂肪酸合成酶复合体。孙利芹孙利芹2011根据酶的组成成份分为根据酶的组成成份分为v单纯酶单纯酶：组成成份中只有蛋白质，其活性取决于蛋白质结构。如组成成份中只有蛋白质，其活性取决于蛋白质结构。如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和核糖核酸酶等脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和核糖核酸酶等

19、v结合酶：结合酶：除了蛋白质外，还有一些被称为辅助因子的小分子。除了蛋白质外，还有一些被称为辅助因子的小分子。辅助因子（辅助因子（cofactorcofactor）分为）分为：无机无机辅助因子（低价金属离子）助因子（低价金属离子）：Fe2+Mg2+Zn2+Mn2+Ca2+有机有机辅助因子（有机小分子）：助因子（有机小分子）：NAD+NADP+FAD FMN G-SH,生物素等生物素等辅酶与辅基：辅酶与辅基：辅助因子与酶蛋白的结合程度辅助因子与酶蛋白的结合程度 孙利芹孙利芹2011三、酶三、酶RNA的空间结构的空间结构v化学结构化学结构 核糖核酸由核苷酸通过磷酸二酯键联结成的。组成核糖核酸由核苷

20、酸通过磷酸二酯键联结成的。组成RNA的的核苷酸种类：核苷酸种类：A G C Uv二级结构二级结构 RNARNA的二级结构是指单链的二级结构是指单链RNARNA分子的自身回折、链内互补分子的自身回折、链内互补碱基配对形成的局部双螺旋区及非配对顺序形成的突环之间碱基配对形成的局部双螺旋区及非配对顺序形成的突环之间的空间排布。的空间排布。在核酸类酶中发现的酶在核酸类酶中发现的酶RNARNA的典型结构有锤头、发夹、多的典型结构有锤头、发夹、多分枝环结构分枝环结构v三级结构三级结构 RNARNA的三级结构是在二级结构的基础上，进一步盘绕折的三级结构是在二级结构的基础上，进一步盘绕折叠而成的三维结构。由于

21、其复杂，加上分析测定方法还有叠而成的三维结构。由于其复杂，加上分析测定方法还有待发展，所以知道不多，不作具体介绍待发展，所以知道不多，不作具体介绍 孙利芹孙利芹2011酶酶RNARNA突环结构示意图突环结构示意图 孙利芹孙利芹2011几种简单的核酸类酶示意图几种简单的核酸类酶示意图 孙利芹孙利芹2011v一级结构的改变使酶的催化功能发生相应的变化一级结构的改变使酶的催化功能发生相应的变化 活性不变活性不变，例如牛胰核糖核酸酶（，例如牛胰核糖核酸酶（124个aa）的）的C-末端去末端去 掉掉3个氨基酸残基；从个氨基酸残基；从M1RNA（377核苷酸）的核苷酸）的3末端末端 切去切去122个核苷酸

22、残基。个核苷酸残基。活性显示，活性显示，例如胰蛋白酶原的活化，从例如胰蛋白酶原的活化，从N-末端切去个六末端切去个六 肽肽Val-(Asp)4-Lys,活性显示。活性显示。活性丧失，活性丧失，例如断裂位置在活性中心附近，牛胰核糖核例如断裂位置在活性中心附近，牛胰核糖核酸酶的酸酶的C-末端去掉末端去掉4个氨基酸残基个氨基酸残基v二级、三级结构破坏使酶的催化活性丧失二级、三级结构破坏使酶的催化活性丧失四、酶的结构与催化功能的关系四、酶的结构与催化功能的关系 孙利芹孙利芹2011v四级结构受到破坏，酶功能和特性发生相应变化四级结构受到破坏，酶功能和特性发生相应变化 多催化部位寡聚酶，多催化部位寡聚酶

23、，亚基分离，一般情况下酶会失活，亚基分离，一般情况下酶会失活，方法适当，保持。如天冬氨酸转氨酶，琥珀酰化法破坏，方法适当，保持。如天冬氨酸转氨酶，琥珀酰化法破坏，分离的分离的2个亚基催化活性保持，酸碱、表面活性剂破坏，个亚基催化活性保持，酸碱、表面活性剂破坏，失活。失活。多酶复合体，多酶复合体，亚基的酶活性减弱或消失亚基的酶活性减弱或消失 别构酶，别构酶，催化亚基保持酶的催化活性，但失去调节功能。催化亚基保持酶的催化活性，但失去调节功能。如天冬氨酸转氨甲酰酶的如天冬氨酸转氨甲酰酶的2个催化亚基个催化亚基C3和和2个调节亚基个调节亚基R2 孙利芹孙利芹2011本节课应掌握的内容v深入了解生物工程

24、研究领域的内涵深入了解生物工程研究领域的内涵v熟悉酶工程的概念及其研究领域（包括化学熟悉酶工程的概念及其研究领域（包括化学酶工程和生物酶工程）酶工程和生物酶工程）v明确酶的各级结构及结构与其催化活性的关明确酶的各级结构及结构与其催化活性的关系系v了解酶有哪几种组成形式？了解酶有哪几种组成形式？孙利芹孙利芹2011v酶的活性中心v酶与底物结合的两种模型v酶促反应的本质1.3 1.3 酶的作用机制酶的作用机制 孙利芹孙利芹2011v掌握酶活性中心的概念v熟悉酶活性中心残基的种类和作用v掌握酶的催化作用机理v了解核酸酶的剪接机制本节课应掌握的内容本节课应掌握的内容 孙利芹孙利芹2011一、酶的活性中

25、心一、酶的活性中心v活性中心（活性中心（active siteactive site）酶分子中显示酶的催化活性的特殊部位。活性中心被破坏，酶分子中显示酶的催化活性的特殊部位。活性中心被破坏，酶失去催化活性。酶失去催化活性。v酶活性中心上的残基酶活性中心上的残基 在酶蛋白分子的众多氨基酸残基中，构成酶的活性中心的在酶蛋白分子的众多氨基酸残基中，构成酶的活性中心的只有少数几个氨基酸残基。如胰凝乳蛋白酶活性中心由只有少数几个氨基酸残基。如胰凝乳蛋白酶活性中心由5 5个个氨基酸残基组成，它们为氨基酸残基组成，它们为Ile16、His57、Aspl02、Lysl94和和Ser195。1960 1960年

26、，柯施兰德（年，柯施兰德（KoshlandKoshland）将酶分子中的氨基酸残基）将酶分子中的氨基酸残基分为以下四类分为以下四类：孙利芹孙利芹2011 接触残基接触残基（contract residues）它们直接与底物接触、参与底物的化学转变，如图中它们直接与底物接触、参与底物的化学转变，如图中的的R1R1、R2R2，R6R6、R8R8、R9R9、R163R163，R164R164、R165R165。这些氨基酸。这些氨基酸残基中的一个或几个原子与底物分子中的一个或几个原子残基中的一个或几个原子与底物分子中的一个或几个原子的距离都在一个键距离（的距离都在一个键距离（1.51.52A2Ao o

27、）之内。）之内。辅助残基辅助残基(auxiliaryresidues)这类残基虽然不与底物直接接触，但在酶与底物结合这类残基虽然不与底物直接接触，但在酶与底物结合以及协助接触基团发挥作用方面起一定的作用。如图以及协助接触基团发挥作用方面起一定的作用。如图2-82-8中中的的R4R4残基残基。接触残基和辅助残基组成酶的活性中心接触残基和辅助残基组成酶的活性中心 孙利芹孙利芹2011 结构残基结构残基(structure residues)这类残基不在酶的活性中心范围内，但是在维持酶分子的完这类残基不在酶的活性中心范围内，但是在维持酶分子的完整的空间结构并使之形成特定的空间构象方面起重要作用。如整

28、的空间结构并使之形成特定的空间构象方面起重要作用。如图中的图中的R10R10、R162R162、R169R169残残基。它们与酶的催化活性的显示有关基。它们与酶的催化活性的显示有关系，又称为贡献残基系，又称为贡献残基(contributing residues)(contributing residues)。结构残基的侧。结构残基的侧链属于活性中心以外的必须基团。链属于活性中心以外的必须基团。上述三类残基统称为必需基团，若被其它氨基酸残基上述三类残基统称为必需基团，若被其它氨基酸残基取代，往往造成酶失活取代，往往造成酶失活 非贡献残基非贡献残基（non-contributing residue

29、s）这类残基对酶活性的显示无明显的作用，可以有其他氨基酸这类残基对酶活性的显示无明显的作用，可以有其他氨基酸残基代替。如图中的残基代替。如图中的R3R3、R5 R5、R7R7等，它们在酶分子中占有很大等，它们在酶分子中占有很大的比例。如木瓜蛋白酶分子中的的比例。如木瓜蛋白酶分子中的2/3氨基酸残基都属于非贡献残氨基酸残基都属于非贡献残基。非贡献残基虽然对酶活性的显示无明显作用，但它们可能基。非贡献残基虽然对酶活性的显示无明显作用，但它们可能在酶的活性调节、酶的运输转移、防止酶的降解、免疫作用或在酶的活性调节、酶的运输转移、防止酶的降解、免疫作用或种系发育等方面起重要作用种系发育等方面起重要作用

30、。孙利芹孙利芹2011接触残基接触残基：R1、R2，R6、R8、R9、R163，R164、R165；辅助残基：辅助残基：R4；结构残基：结构残基：R10、R162、R169；非贡献残基：非贡献残基：R3、R5、R7 孙利芹孙利芹2011 酶蛋白分子中的各种氨基酸残基的作用可以酶蛋白分子中的各种氨基酸残基的作用可以归纳如下归纳如下:酶酶分分子子接触残基接触残基辅助残基辅助残基结构残基结构残基非贡献残基非贡献残基催化活性催化活性显示作用显示作用活性中心活性中心与底物结合、与底物结合、催化作用催化作用协助催化作用协助催化作用活性调节、运输转移等其它方面作用活性调节、运输转移等其它方面作用活性中心外活

31、性中心外(维持空间构象作用维持空间构象作用)有有7 7种氨基酸参与蛋白酶类的活性中心的频率最高：种氨基酸参与蛋白酶类的活性中心的频率最高：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。孙利芹孙利芹2011酶的活性中心示意图酶的活性中心示意图 I I 孙利芹孙利芹2011酶的活性中心示意图酶的活性中心示意图 II II 孙利芹孙利芹2011常见酶的活性中心上的残基常见酶的活性中心上的残基 酶酶 活性中心上的残基活性中心上的残基胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶Ilu16,His57,Asp 102,Lys 194,Ser195,胰蛋白酶胰蛋白酶His46,Ser183枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶

32、Ser221,His64核糖核酸酶核糖核酸酶His12,Lys41,His119,碱性磷酸酶碱性磷酸酶Ser,His,Zn+木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶Cys25,His159,乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶Cys,His,Tyr延胡索酸酶延胡索酸酶Met,His6磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶Lys,His,Tyr,Tyr 孙利芹孙利芹2011 核酸类酶的活性中心核酸类酶的活性中心v活性中心活性中心:酶酶RNA RNA 的一段核苷酸序列的一段核苷酸序列vL-19IVSL-19IVS剪接酶的活性中心是该酶剪接酶的活性中心是该酶RNARNA第第22-2722-27位的位的核苷酸序列核苷酸序列:5-GGAGGG-

33、3,:5-GGAGGG-3,当通过碘酸氧化法当通过碘酸氧化法除去除去3-G3-G成为成为L-394 nt RNAL-394 nt RNA时时,酶丧失催化能力酶丧失催化能力v点突变法改变点突变法改变L-19IVSL-19IVS的催化中心的催化中心,其催化活性改变其催化活性改变v活性中心外的核酸酸残基中活性中心外的核酸酸残基中,不同的核苷酸序列对不同的核苷酸序列对酶活性的贡献不同酶活性的贡献不同 孙利芹孙利芹2011二、酶与底物结合的两种模型二、酶与底物结合的两种模型vFisher锁和钥匙模型锁和钥匙模型（Lock-and key model）底物的形状和酶的活底物的形状和酶的活性部位被认为彼此相

34、适性部位被认为彼此相适合，象钥匙插在它的锁合，象钥匙插在它的锁中，两种形状被认为是中，两种形状被认为是刚性的（刚性的（rigidrigid），和），和固定的（固定的（fixedfixed）当正）当正确组合在一起时，正好确组合在一起时，正好相互补充。相互补充。J 孙利芹孙利芹2011v诱导契合模型诱导契合模型（induced-fit model）19581958年年koshlandkoshland提出，酶分提出，酶分子的构象受底物分子的诱导会子的构象受底物分子的诱导会发生变化，此外酶可以使底物发生变化，此外酶可以使底物变形，迫使其构象近似于它的变形，迫使其构象近似于它的过渡态。过渡态。根据根据X

35、 X射线结晶衍射与各射线结晶衍射与各种光谱学对溶菌酶、羧肽酶、种光谱学对溶菌酶、羧肽酶、乳酸脱氢酶的分析，酶在捕捉乳酸脱氢酶的分析，酶在捕捉底物释放产物前后其构象却又底物释放产物前后其构象却又很剧烈的变化很剧烈的变化 孙利芹孙利芹2011诱导契合学说的要点诱导契合学说的要点v酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板v底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性结底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性结合）合）v当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形成正确的排列。成正确的排列。v在酶反应过程中，酶

36、活性中心构象的变化是可逆的。在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是可逆的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，反应结束即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，反应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。孙利芹孙利芹2011两个学说的比较两个学说的比较 孙利芹孙利芹2011v酶的催化机理研究方法：酶的催化机理研究方法：从非酶系统模式获得催化作用规律从非酶系统模式获得催化作用规律。优点：反应简单，易于探究优点：反应简单，易于探究 缺点：非酶系统与酶系统不同，实验结果不一定完全适合缺点：非酶系统与酶系统不同，实验结果不一定完全适合 从酶结构和功能研究中

37、得到催化作用机理的证据从酶结构和功能研究中得到催化作用机理的证据 根据两种方法的研究结果，酶的催化作用可能来根据两种方法的研究结果，酶的催化作用可能来自自5个方面：个方面：酶的趋近与定向效应、构象变化效应、酸碱催化机制、共价催化和微环境效应。三、三、酶促反应的本质酶促反应的本质 孙利芹孙利芹20111 1、酶的趋近与定向效应、酶的趋近与定向效应v邻近效应邻近效应：在酶促反应中，由于酶和底物分子之在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性

38、中心的有效浓度大大增加性中心的有效浓度大大增加。v定向效应定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相会诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。使酶促反应易于进行。v两种效应使酶具有高效率和专一性特点。两种效应使酶具有高效率和专一性特点。孙利芹孙利芹2011趋近与定向的几种情况趋近与定向的几种情况 孙利芹孙利芹2011反应实例反应实例v对

39、硝基苯酯以三甲胺催化水解反应，因胺基逼近羰基，反应对硝基苯酯以三甲胺催化水解反应，因胺基逼近羰基，反应机会机会 速度增加速度增加50005000倍。倍。N(CH3)3+ONO2CH3COK=413/M.molCH2ONO2COCH2CH2N(CH3)2K=21500/M.molOHCH2COOHCH2邻酚丙酸邻酚丙酸CH3OHCCOOHCH2CH3CH3CH3二甲酚异丁酸二甲酚异丁酸V=4*105倍倍趋趋近近定定向向 孙利芹孙利芹2011趋近与定向效应对酶催化的作用趋近与定向效应对酶催化的作用v使底物分子在酶活性中心附近的浓度升高，有利于反应使底物分子在酶活性中心附近的浓度升高，有利于反应速度

40、加快；速度加快；v酶活性中心上的基团对底物分子具有轨道导向作用，减酶活性中心上的基团对底物分子具有轨道导向作用，减少反应所需的活化能；少反应所需的活化能；v生成中间产物，使分子间反应变成分子内反应，提高反生成中间产物，使分子间反应变成分子内反应，提高反应速度；应速度；v生成的中间产物生成的中间产物ES寿命长（寿命长（10-710-4s）,反应速率高反应速率高,称为称为底物的固定作用底物的固定作用(substrate anchoring)孙利芹孙利芹20112 2、构象变化效应、构象变化效应vDefine:Define:酶分子与底物分子互相接近时，两者都会发生构酶分子与底物分子互相接近时，两者都

41、会发生构象的变化，有利于酶和底物的结合反应。象的变化，有利于酶和底物的结合反应。底物诱导酶分子构象的变化底物诱导酶分子构象的变化 孙利芹孙利芹2011 活性部位由活性部位由Arg145 Tyr248 Glu270组成，当酶与底物组成，当酶与底物甘甘氨酰氨酰-酪氨酸酪氨酸结合时，三者分别移动结合时，三者分别移动2A2A0 0,2A2A0 0,12A12A0 0,从亲从亲水表面移向肽键附近的疏水区。采用水表面移向肽键附近的疏水区。采用赖氨酰赖氨酰-酪酰胺酪酰胺代替，代替，则不能够产生变形。则不能够产生变形。孙利芹孙利芹2011 酶诱导底物分子构象的变化酶诱导底物分子构象的变化 张力与形变：张力与形

42、变：酶与底物的结合，不仅酶分子发生构象变化，酶与底物的结合，不仅酶分子发生构象变化，同样底物分子也会发生扭曲变形，使底物分子的敏感键发生同样底物分子也会发生扭曲变形，使底物分子的敏感键发生 变形或张力，从而使底物的敏感键更易于破裂。变形或张力，从而使底物的敏感键更易于破裂。酶使底物分子中的敏感键发生变形酶使底物分子中的敏感键发生变形（distortiondistortion）孙利芹孙利芹2011非酶系统中存在变形或张力加速反应速度的实例非酶系统中存在变形或张力加速反应速度的实例化合物化合物1 1的水解的水解速度是化合物速度是化合物2 2的的10108 8这是因为这是因为前者的反应物前者的反应物

43、中的环状结构中的环状结构存在张力，表存在张力，表示张力或变形示张力或变形可是反应速度可是反应速度加快。加快。孙利芹孙利芹20113 3、广义的酸碱催化、广义的酸碱催化vDefine:Define:酶和底物之间通过质子（酶和底物之间通过质子（H H+）的传递，即酸和碱的）的传递，即酸和碱的相互转变而降低反应所需的活化能，使反应速度加快。相互转变而降低反应所需的活化能，使反应速度加快。广义的酸碱：广义的酸碱：供给质子和接受质子的物质。如供给质子和接受质子的物质。如CHCH3 3COOHCOOH为为 共轭酸共轭酸 CHCH3 3COOCOO-为共轭碱为共轭碱 在酸的催化反应中，在酸的催化反应中，H

44、H+与反应物结合，其结合物更具反应与反应物结合，其结合物更具反应性，因而反应速度加快性，因而反应速度加快 HA+X=XH+AHA+X=XH+A-XH=Y+XH=Y+H H+依同理，当碱为催化剂时，从反应物中移去依同理，当碱为催化剂时，从反应物中移去H H+AXH+BAXH+B-=Y+BH+A=Y+BH+A-孙利芹孙利芹2011v酶蛋白中可以作为广义酸碱的功能基团酶蛋白中可以作为广义酸碱的功能基团 孙利芹孙利芹2011酶的酸碱催化机制示意图酶的酸碱催化机制示意图 I I 孙利芹孙利芹2011酶的酸碱催化机制示意图酶的酸碱催化机制示意图 II II 孙利芹孙利芹20114 4、共价催化、共价催化v

45、Define:Define:底物与酶以共价方式形成中间产物，这种中底物与酶以共价方式形成中间产物，这种中间产物可以很快转变为活化能间产物可以很快转变为活化能大为降低的转变态，从而提大为降低的转变态，从而提高催化反应速度。分为亲核催化和亲电催化两种。高催化反应速度。分为亲核催化和亲电催化两种。v亲电试剂亲电试剂，指具有强烈的亲和电子的原子中心，如：，指具有强烈的亲和电子的原子中心，如：Mg2+NH4+C=O C=Nv亲核试剂：亲核试剂：指具有强烈的供给电子的原子中心，如指具有强烈的供给电子的原子中心，如 H2N:O:H S:H HCOO-亲核催化亲核催化:酶分子的富电子基团攻击底物的缺电子基团而

46、酶分子的富电子基团攻击底物的缺电子基团而 形成共价中间产物的过程形成共价中间产物的过程亲电催化亲电催化:孙利芹孙利芹2011以蔗糖磷酸化酶催化蔗糖磷酸解反应为例以蔗糖磷酸化酶催化蔗糖磷酸解反应为例 孙利芹孙利芹2011常见的共价催化基团常见的共价催化基团 孙利芹孙利芹2011酶的亲核催化机制示例酶的亲核催化机制示例 孙利芹孙利芹20115 5、微环境效应、微环境效应vDefine 微环境微环境是指酶的活性中心上的催化基团所处的一种特殊是指酶的活性中心上的催化基团所处的一种特殊的疏水反应环境。的疏水反应环境。由于酶分子活性中心的催化基团处于特殊的疏水反应环境，影由于酶分子活性中心的催化基团处于特

47、殊的疏水反应环境，影响酶与底物的结合，并影响催化基团的解离，使反应加速进行，响酶与底物的结合，并影响催化基团的解离，使反应加速进行，这种作用称为微环境效应。这种作用称为微环境效应。许多有机化学反应会受到其溶剂环境的影响许多有机化学反应会受到其溶剂环境的影响,如叠氮盐与硝如叠氮盐与硝基氟苯的反应：基氟苯的反应：N3-+FNO2F-+N3NO2在二甲亚砜中进行时的速度比在水中进行时快在二甲亚砜中进行时的速度比在水中进行时快1200012000倍倍 孙利芹孙利芹2011微环境效应的作用微环境效应的作用 孙利芹孙利芹2011v溶菌酶催化的微环境效应溶菌酶催化的微环境效应 孙利芹孙利芹2011核酶的自我

48、剪接机制核酶的自我剪接机制v自我剪接的核酸类酶通过酶自我剪接的核酸类酶通过酶RNARNA或其辅助因子或其辅助因子上所含的嘌呤上所含的嘌呤-OH-OH攻击分子本身的剪接点攻击分子本身的剪接点.催化催化自我剪接反应自我剪接反应v型型IVS(IVS(与四膜虫与四膜虫26SrRNA26SrRNA前体的前体的IVSIVS结构相似结构相似的间隔序列的间隔序列)v 型型IVSIVS剪接酶剪接酶(与细胞核与细胞核mRNAmRNA的的IVSIVS结构相似结构相似的间隔序列的间隔序列,在植物和低等真核生物的细胞器基因组中发现)孙利芹孙利芹2011第一步第一步:GTPGTP的的3-OH3-OH作用作用左边外显子和内

49、含子交界处的左边外显子和内含子交界处的磷酸二酯键，本身结合到内含磷酸二酯键，本身结合到内含子的子的55末端，被切下的末端，被切下的55外外显子仍保持在底物位点上，并显子仍保持在底物位点上，并未游离。未游离。第二步第二步:内含子的内含子的G414G414（即（即33交界序列上的交界序列上的G G）又进入了）又进入了G-G-结合位点，切下的外显子的结合位点，切下的外显子的3-OH3-OH又对又对G-G-结合位点上的结合位点上的G G与与33外显子之间的磷酸二酯外显子之间的磷酸二酯键发动亲核进攻，切开磷酸二键发动亲核进攻，切开磷酸二酯键，而其酯键，而其3-OH3-OH和和33外显外显子的子的P P重

50、新形成磷酸二酯键而重新形成磷酸二酯键而连接起来连接起来型型IVS剪接机制剪接机制 孙利芹孙利芹2011v第三步第三步:生成的生成的414nt414nt的环状内含子的环状内含子G-IVS G-IVS 进一步自进一步自动反应动反应,通过两次环化成生成通过两次环化成生成L-19IVSL-19IVS3-OH3-OH进攻进攻55端第端第1515、1616两个碱基之间的磷酸二酯键进行两个碱基之间的磷酸二酯键进行亲核亲核进攻，切下亲核亲核进攻，切下15nt15nt的小片段，余下的的小片段，余下的399nt399nt的间插序的间插序列（列（interveling sequenceinterveling seq