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1、第八章第八章 酶学通论酶学通论酶酶,enzymeenzyme希腊语原意希腊语原意:in yeastin yeast生命体内催化化学反应的物质生命体内催化化学反应的物质细胞中大部分球蛋白为酶细胞中大部分球蛋白为酶19191919世纪中叶对发酵本质的探讨：世纪中叶对发酵本质的探讨：世纪中叶对发酵本质的探讨：世纪中叶对发酵本质的探讨：1857185718571857年年年年 Pasteur Pasteur Pasteur Pasteur认为发酵分几个阶段进行认为发酵分几个阶段进行认为发酵分几个阶段进行认为发酵分几个阶段进行,每一每一每一每一步都有特定的酶参与步都有特定的酶参与步都有特定的酶参与步都有
2、特定的酶参与,但酶只在活体细胞中才能起但酶只在活体细胞中才能起但酶只在活体细胞中才能起但酶只在活体细胞中才能起作用。发酵是酵母细胞活动的结果。作用。发酵是酵母细胞活动的结果。作用。发酵是酵母细胞活动的结果。作用。发酵是酵母细胞活动的结果。1897189718971897年年年年 Bchner Bchner Bchner Bchner兄弟用酵母提取液实现发酵，证兄弟用酵母提取液实现发酵，证兄弟用酵母提取液实现发酵，证兄弟用酵母提取液实现发酵，证明了酶可以离开细胞起作用。明了酶可以离开细胞起作用。明了酶可以离开细胞起作用。明了酶可以离开细胞起作用。酶的名称酶的名称酶的名称酶的名称187818781
3、8781878年年年年 Khne Khne Khne Khne提出提出提出提出enzymeenzymeenzymeenzyme一词：一词：一词：一词：“在酵母中在酵母中在酵母中在酵母中”。1898189818981898年年年年 Duclaux Duclaux Duclaux Duclaux提出用后缀提出用后缀提出用后缀提出用后缀“ase”“ase”“ase”“ase”表示酶。表示酶。表示酶。表示酶。一、酶学研究史一、酶学研究史酶促动力学酶促动力学酶促动力学酶促动力学1894189418941894年年年年 Fisher Fisher Fisher Fisher提出酶与底物作用的提出酶与底物作
4、用的提出酶与底物作用的提出酶与底物作用的“锁钥锁钥锁钥锁钥”学说学说学说学说1913191319131913年年年年 Michaelis Michaelis Michaelis Michaelis 和和和和 Menton Menton Menton Menton米氏方程建立。米氏方程建立。米氏方程建立。米氏方程建立。关于酶的化学本质的认识：关于酶的化学本质的认识：关于酶的化学本质的认识：关于酶的化学本质的认识：1833183318331833年年年年 Payen Payen Payen Payen 和和和和 Persoz Persoz Persoz Persoz从麦芽的水抽提物中用从麦芽的水抽
5、提物中用从麦芽的水抽提物中用从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一种热不稳定物质酒精沉淀得到一种热不稳定物质酒精沉淀得到一种热不稳定物质酒精沉淀得到一种热不稳定物质,可使淀粉水解成可使淀粉水解成可使淀粉水解成可使淀粉水解成可溶性糖。可溶性糖。可溶性糖。可溶性糖。1926192619261926年年年年 Sumner Sumner Sumner Sumner首次从刀豆中得到脲酶结晶，并证首次从刀豆中得到脲酶结晶，并证首次从刀豆中得到脲酶结晶，并证首次从刀豆中得到脲酶结晶，并证明其化学本质是蛋白质。明其化学本质是蛋白质。明其化学本质是蛋白质。明其化学本质是蛋白质。1982198219821982年年年
6、年 Thomas R Cech Thomas R Cech Thomas R Cech Thomas R Cech从四膜虫发现从四膜虫发现从四膜虫发现从四膜虫发现rRNArRNArRNArRNA的自身的自身的自身的自身催化作用，并提出了核酶（催化作用，并提出了核酶（催化作用，并提出了核酶（催化作用，并提出了核酶（ribozymeribozymeribozymeribozyme）的概念。）的概念。）的概念。）的概念。限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现1970197019701970年年年年 Restriction enzyme Restriction enz
7、yme Restriction enzyme Restriction enzyme的发现的发现的发现的发现基因工程。基因工程。基因工程。基因工程。酶学研究史酶学研究史二、酶是生物催化剂二、酶是生物催化剂uu 酶是一种催化剂酶是一种催化剂酶是一种催化剂酶是一种催化剂1.1.1.1.进行热力学上允许进行的反应；进行热力学上允许进行的反应；进行热力学上允许进行的反应；进行热力学上允许进行的反应；2.2.2.2.缩短化学反应平衡到达的时间，而不改变反应缩短化学反应平衡到达的时间，而不改变反应缩短化学反应平衡到达的时间，而不改变反应缩短化学反应平衡到达的时间，而不改变反应的平衡点；的平衡点；的平衡点；的
8、平衡点；3.3.3.3.用量少而催化效率高；用量少而催化效率高；用量少而催化效率高；用量少而催化效率高；4.4.通过降低活化能加快化学反应速度。通过降低活化能加快化学反应速度。例例 2H 2H2 2O O2 2 2H 2H2 2O+OO+O2 2 反反 应应活化能活化能非催化反应非催化反应75.24kJ/mol75.24kJ/mol钯催化反应钯催化反应48.9kJ/mol48.9kJ/molH H2 2O O2 2酶催化酶催化8.36kJ/mol8.36kJ/mol（1 1）高的催化效率）高的催化效率 以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高
9、剂高10107 710101313倍，比非催化反应高倍，比非催化反应高10108 810102020倍。倍。例例 2H 2H2 2O O2 22H2H2 2O+OO+O2 2 1mole H1mole H2 2O O2 2酶酶 能催化能催化 510 5106 6mole Hmole H2 2O O2 2的分解的分解 1mole Fe1mole Fe3+3+只能催化只能催化610610-4-4mole Hmole H2 2O O2 2的分解的分解 uu 酶是特殊的催化剂酶是特殊的催化剂酶是特殊的催化剂酶是特殊的催化剂酶与一般催化剂催化效率的比较酶与一般催化剂催化效率的比较底物底物 催化剂催化剂
10、反应温度反应温度 反应速度常数反应速度常数尿素尿素 H+62 7.4 10-7 脲酶脲酶 21 5.0 106过氧化氢过氧化氢 Fe 2+22 56 过氧化氢酶过氧化氢酶 22 3.5 107 通常要高出一般催化剂催化活性的通常要高出一般催化剂催化活性的通常要高出一般催化剂催化活性的通常要高出一般催化剂催化活性的10107 7-10-101313倍。倍。倍。倍。转换数（转换数（turnover number,kturnover number,kcatcat）:每秒钟或每分每秒钟或每分钟，每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟或每钟，每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟或每分钟每摩尔酶转换底物的摩
11、尔数。分钟每摩尔酶转换底物的摩尔数。2.2.2.2.高度专一性高度专一性高度专一性高度专一性3.3.3.3.可调控性可调控性可调控性可调控性 如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共价修饰调节、酶原活化等。价修饰调节、酶原活化等。4.4.4.4.反应条件温和反应条件温和 生物固氮：生物固氮：工业氨合成：工业氨合成：5.5.酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关 N2+3H2 500,300大气压大气压Fe2NH3uu 酶是生物催化剂酶是生物催化剂酶是
12、生物催化剂酶是生物催化剂1.1.1.1.生物体产生的；化学本质是蛋白质（直接、间接生物体产生的；化学本质是蛋白质（直接、间接生物体产生的；化学本质是蛋白质（直接、间接生物体产生的；化学本质是蛋白质（直接、间接证据）；证据）；证据）；证据）；2.2.2.2.与生命活动密切相关。与生命活动密切相关。与生命活动密切相关。与生命活动密切相关。6CO2+6H2O+能量能量 C6H12O6+6O2 植物植物动物动物N N2 2+3H+3H2 2 2NH 2NH3 3某些微生物某些微生物三、酶的化学本质三、酶的化学本质 1 1大多数酶是蛋白质大多数酶是蛋白质19261926年美国年美国SumnerSumne
13、r脲酶的结晶，并指出酶是蛋白脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质。质。19301930年年NorthropNorthrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。蛋白质。20 20世纪世纪8080年代发现某些年代发现某些RNARNA有催化活性，还有有催化活性，还有一些抗体也有催化活性，甚至有些一些抗体也有催化活性，甚至有些DNADNA也有催化活也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。酶的定义：酶的定义：生命体内具有催化化学反应活性生命体内具有催化化学反应
14、活性的蛋白质为酶。的蛋白质为酶。酶为生命体内具有催化化学反应活性的生物酶为生命体内具有催化化学反应活性的生物大分子。大分子。四、酶的组成四、酶的组成 1 1单纯蛋白质酶类单纯蛋白质酶类 仅由氨基酸组成。仅由氨基酸组成。如脲酶、如脲酶、胃蛋白酶等一般水解酶。胃蛋白酶等一般水解酶。2 2缀合蛋白质酶类缀合蛋白质酶类 蛋白质蛋白质+非蛋白质部分非蛋白质部分 全酶全酶=脱辅酶（酶蛋白）脱辅酶（酶蛋白）+辅助因子辅助因子 （辅酶、辅基或金属离子）（辅酶、辅基或金属离子）辅酶（辅酶（coenzymecoenzyme）辅基（辅基（prosthetic groupprosthetic group）全酶全酶(h
15、oloenzyme)|酶蛋白（酶蛋白（apoenzyme)+辅助因子辅助因子（cofactor)cofactor 辅基，辅基，prosthetic group辅酶，辅酶，co-enzyme金属离子金属离子结合力强结合力强酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅助因子酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅助因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的传递体。通常是作为电子、原子或某些化学基团的传递体。v单体酶（单体酶（monomeric enzyme)monomeric enzyme)：由一条肽链组：由一条肽链组成，全部参与水解反应。成，全部参与水解反应。v寡聚酶寡聚酶(oligomeric enzy
16、me)(oligomeric enzyme)：由几个或多个：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。大多有催化活性。亚基之间以非共价键结合。大多为代谢调控酶。为代谢调控酶。根据酶蛋白分子的特点将酶分成三类根据酶蛋白分子的特点将酶分成三类v 多酶复合体多酶复合体 (multienzymemultienzyme complex)complex)：几个酶嵌合而成的复合物。这些酶催化将底物转化几个酶嵌合而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。如丙酮酸脱氢酶复合体为产物的一系列顺序反应。如丙酮酸脱氢
17、酶复合体由丙酮酸脱氢酶（由丙酮酸脱氢酶（EE）、硫辛酰转乙酰酶（）、硫辛酰转乙酰酶（EE）和二氢硫辛酰脱氢酶（和二氢硫辛酰脱氢酶（EE）组成。）组成。五、酶的命名和分类五、酶的命名和分类 1961 1961年国际酶学委员会（年国际酶学委员会（enzyme commissionenzyme commission）提出的酶的命名和分类方法。提出的酶的命名和分类方法。每一个酶由下列三种表示：每一个酶由下列三种表示：1 1、系统名称：底物名、系统名称：底物名+反应性质反应性质 2 2、分类编号：、分类编号：E.C.+E.C.+四个数字四个数字 3 3、推荐名：选一个习惯名（实用、简单）、推荐名：选一个
18、习惯名（实用、简单）（一）命名（一）命名 1 1系统名称（系统名称（systematic namesystematic name）（1 1）标明底物和催化反应的性质）标明底物和催化反应的性质 G-6-PF-6-P G-6-PG-6-PF-6-P G-6-P异构酶异构酶 例例:（2 2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（冒号（:）分开。如其中一个底物为水时，水可）分开。如其中一个底物为水时，水可略去。略去。例例1 1：丙氨酸丙氨酸+-+-酮戊二酸酮戊二酸 谷氨酸谷氨酸+丙酮酸丙酮酸 丙氨酸丙氨酸:-:-酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶 例例2 2
19、：脂肪脂肪+H+H2 2O O 脂酸脂酸+甘油甘油 脂肪水解酶脂肪水解酶 2 2习惯名称（习惯名称（recommended namerecommended name）（1 1）底物）底物 （2 2）反应性质）反应性质 （3 3）底物）底物+反应性质反应性质 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 （4 4）底物）底物+来源或其它特点来源或其它特点 （二）系统分类法及编号（二）系统分类法及编号 1 1分类分类:根据催化反应的性质分根据催化反应的性质分6 6大类酶大类酶 1.1.氧化还原酶类氧化还原酶类 oxidoreductase oxidoreductase 2.2.转移酶类转移酶类 transferase t
20、ransferase 3.3.水解酶类水解酶类 hydrolase hydrolase 4.4.裂合酶类裂合酶类 lyase lyase 5.5.异构酶类异构酶类 isomerase isomerase 6.6.连接酶类连接酶类 ligase/synthetase ligase/synthetase2 2编号编号:用用4 4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“”“”隔开，前面冠以隔开，前面冠以ECEC（为（为Enzyme CommissionEnzyme Commission）。）。EC EC 类类.亚类亚类.亚亚类亚亚类.排号，如排号，如EC l.1.1.1 E
21、C l.1.1.1 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC 1.1.1.27第第1大类，氧化还原酶大类，氧化还原酶第第1亚类，氧化基团亚类，氧化基团CHOH第第1亚亚类，亚亚类，H受体为受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号该酶在亚亚类中的流水编号（三）六大类酶催化反应的性质（三）六大类酶催化反应的性质 1 1氧化还原酶类（氧化还原酶类（oxido-reductasesoxido-reductases）主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。催化氧化还原反应的酶，包括氧化反应。催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶类、脱氢酶类、过氧化
22、氢酶、过氧化物酶等。酶等。（1 1）氧化酶类：）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成催化底物脱氢，并氧化生成H H2 2O O或或H H2 2O O2 2 。2A2A2H2H+O+O2 2 2A+22A+2H H2 2O O AA2H2H+O+O2 2 A+A+H H2 2O O2 2 例：邻苯二酚氧化酶例：邻苯二酚氧化酶（，邻苯二酚：氧氧化酶）（，邻苯二酚：氧氧化酶）邻苯二酚邻苯二酚邻苯醌邻苯醌（2 2）脱氢酶类：直接催化底物脱氢）脱氢酶类：直接催化底物脱氢 AA2H2H+B+B A+BA+B2H2H 例：乳酸脱氢酶（）例：乳酸脱氢酶（）L-L-乳酸：乳酸：NADNAD+氧化还原酶）氧化还原酶
23、）乳酸乳酸丙酮酸丙酮酸2 2转移酶类（转移酶类（transferasestransferases）催化基团的转移催化基团的转移,分成分成8 8个亚类：转移碳基、酮个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。基和含硫基的酶。例：谷丙转氨酶（例：谷丙转氨酶（GPTGPT）（）（）L-L-丙氨酸：丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶）酮戊二酸氨基转移酶）3 3水解酶类（水解酶类（hydrolaseshydrolases）AB+AB+H H2 2O O A AOHOH+B+BH H 催化加水分解作用。催化加水分解作用。4 4裂合酶类（裂合
24、酶类（lyaseslyases）从底物非氧化非水解性地移去一个基团并形成双从底物非氧化非水解性地移去一个基团并形成双键的反应或其逆反应。键的反应或其逆反应。A AB B A A+B B 例例1 1：例例2 2：5 5异构酶类（异构酶类（isomeraseisomerase）催化异构化反应催化异构化反应,常见的有消旋和变旋、醛酮常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。异构、顺反异构和变位酶类。例：例：6 6连接酶类（连接酶类（ligases,ligases,也称也称synthetasessynthetases合成酶类）合成酶类）将两个小分子合成一个大分子，通常需要将两个小分子合成一个大
25、分子，通常需要ATPATP供能。供能。例：例：（连接酶）（异构）（裂合）（水解）氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶转移酶转移酶转移酶转移酶水解酶水解酶水解酶水解酶裂合酶裂合酶裂合酶裂合酶异构酶异构酶异构酶异构酶连接酶连接酶连接酶连接酶酶作用的酶作用的专一性专一性结构结构专一性专一性立体异构立体异构专一性专一性相对专一性相对专一性绝对专一性绝对专一性六、酶专一性六、酶专一性 specificity specificity键的专一性键的专一性基团专一性基团专一性1、绝对专一性（、绝对专一性（absolute specificity）只能作用于某一底物。只能作用于某一底物。例例:（1 1）族专
26、一性（基团专一性，）族专一性（基团专一性，group specificitygroup specificity）2 2、相对专一性（、相对专一性（relative specificityrelative specificity）作用于一类化合物。作用于一类化合物。A A B B或或A A B B如如-D-D-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 （2 2）键专一性）键专一性 作用一种化学键作用一种化学键A BA B2 2、立体专一性（、立体专一性（stereospecificitystereospecificity）只能催化一种立体异构体进行反应。只能催化一种立体异构体进行反应。（1 1）D-D-，L-L-立
27、体异构专一性立体异构专一性 L-L-乳酸脱氢酶：作用于乳酸脱氢酶：作用于L-L-乳酸乳酸（2）几何异构专一性）几何异构专一性 延胡索酸酶：作用于反式的丁烯二酸延胡索酸酶：作用于反式的丁烯二酸（3 3）酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子）酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子中两个等同的基团，只催化其中的一个基团，而不中两个等同的基团，只催化其中的一个基团，而不催化另一个。催化另一个。例例1 1：若甘油激酶不能区分两个若甘油激酶不能区分两个CHCH2 2OHOH基团，则会生成基团，则会生成:和和例例2 2：关于酶作用专一性的几种假说关于酶作用专一性的几种假说 1 1、锁钥学说（、锁钥学说
28、（lock and Key theorylock and Key theory）18941894年年 Fischer Fischer 提出提出:酶的活性中心结构与底酶的活性中心结构与底物的结构互相吻合，紧密结合成中间络合物。物的结构互相吻合，紧密结合成中间络合物。2 2、三点附着学说、三点附着学说 3 3、诱导契合学说（、诱导契合学说（induced-fit theoryinduced-fit theory）19581958年年 Koshland Koshland 提出提出:酶活性中心的结构有酶活性中心的结构有一定的柔性，当酶分子与底物酶分子接近时，一定的柔性，当酶分子与底物酶分子接近时，酶蛋
29、白受底物分子诱导，构象发生了有利于与酶蛋白受底物分子诱导，构象发生了有利于与底物结合的变化，使活性中心的有关基团正确底物结合的变化，使活性中心的有关基团正确地排列和定向，酶和底物契合结合成中间络合地排列和定向，酶和底物契合结合成中间络合物，引起底物发生反应。物，引起底物发生反应。v酶活力（酶活力（enzyme activityenzyme activity）是指酶催化某一化学）是指酶催化某一化学反应的能力。反应的能力。七、酶的分离纯化和活力测定七、酶的分离纯化和活力测定产产 物物 浓浓 度度 PP(t)(t)测定酶活力时应注意几点测定酶活力时应注意几点 （1 1）应测反应初速度（）应测反应初速
30、度（initial velocityinitial velocity）底物浓度变化在起始浓度底物浓度变化在起始浓度5%5%以内。以内。（2 2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。加量来表示。（3 3）测酶活力时应使反应温度、）测酶活力时应使反应温度、pHpH、离子强度和、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。底物浓度等因素保持恒定。（4 4）测定酶反应速度时，应使）测定酶反应速度时，应使SESE。vv酶活力单位酶活力单位酶活力单位酶活力单位（U）：在一定条件下，一定时间内：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量（将一定量的底物
31、转化为产物所需的酶量（U/g，U/ml）。v在最适的反应条件（在最适的反应条件（25）下，每分钟内催化一）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即位，即 1IU=1mol/minv在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为物所需的酶量定为1kat单位，即单位，即1kat=1mol/sv酶的酶的比活力比活力比活力比活力（代表酶的纯度）：每（代表酶的纯度）：每mg蛋白质所蛋白质所含的酶活力单位数。含的酶活力单位数。酶的比活力或比活性（酶的比活力或比活性（specific a
32、ctivityspecific activity）比活力：指每比活力：指每mgmg蛋白质所具有的酶活力，一般用蛋白质所具有的酶活力，一般用 U/mgU/mg蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。比活力比活力=酶活力（酶活力（U/mlU/ml）/蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mlmg/ml）比活力有时也可用每比活力有时也可用每g g或每或每mlml酶含多少个活力单酶含多少个活力单位来表示。位来表示。酶活力的测定方法酶活力的测定方法 （1 1）分光光度法（）分光光度法（spectrophotometryspectrophotometry）该法要求酶的底物和产物在紫外或
33、可见光部分该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。光吸收不同。优点：简便、迅速、准确；一个样品可多次测优点：简便、迅速、准确；一个样品可多次测定；可检测到定；可检测到10-9mol/L10-9mol/L水平的变化。水平的变化。例例:人血清乳酸脱氢酶活力的测定人血清乳酸脱氢酶活力的测定 L-L-乳酸乳酸+NAD+NAD+丙酮酸丙酮酸+NADH+H+NADH+H+乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（2 2）荧光法（）荧光法（fluorometryfluorometry）该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。主要的优点：灵敏度很高，可测主要的优点：灵敏度很高，可测
34、1010-12-12mol/Lmol/L的样的样品。品。酶蛋白分子中的酶蛋白分子中的TyrTyr、TrpTrp、PhePhe残基以及一些残基以及一些辅酶、辅基，如辅酶、辅基，如NADH NADPHNADH NADPH、FMNFMN、FADFAD等都等都能发出荧光。能发出荧光。例：乙醇例：乙醇+NAD+NAD+乙醛乙醛+NADH+H+NADH+H+乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶（3 3）酶偶联分析法）酶偶联分析法(enzyme coupling assay)(enzyme coupling assay)第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。个酶系统在一
35、起反应。P P1 1无光吸收或荧光变化，偶联后无光吸收或荧光变化，偶联后,P,P2 2有光吸有光吸收或荧光变化。收或荧光变化。例：测己糖激酶的活性例：测己糖激酶的活性 葡萄糖葡萄糖+ATP +ATP 葡糖葡糖-6-6-磷酸磷酸+ADP +ADP 己糖激酶己糖激酶葡糖葡糖-6-6-磷酸磷酸+NADP +NADP 葡糖酸葡糖酸-6-6-磷酸磷酸+NADPH+H+NADPH+H+G-6-PG-6-P脱氢酶脱氢酶（4 4）电化学法（）电化学法（electrochemical methodelectrochemical method）有离子选择性电极法、微电子电位法、电流法等。有离子选择性电极法、微电子
36、电位法、电流法等。离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子浓度的变化或气体的变化（如浓度的变化或气体的变化（如O O2 2、COCO2 2、NHNH3 3等）。等）。例例:葡萄糖氧化酶活性的测定葡萄糖氧化酶活性的测定 葡萄糖葡萄糖+O+O2 2+H+H2 2O O 葡糖酸葡糖酸+H+H2 2O O2 2 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（5 5）同位素法）同位素法1 1选材选材 2 2破碎细胞破碎细胞 3 3抽提抽提 4 4分离及纯化分离及纯化 5 5结晶结晶 6 6保存保存 酶的分离纯化酶的分离纯化酶的分离纯化酶的分离纯化溶溶解解度度的的差差异异盐析法
37、盐析法PEGPEG沉淀法沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法热稳定性的差异热稳定性的差异热处理沉淀法热处理沉淀法电荷性质的差异电荷性质的差异离子交换层析法离子交换层析法电泳法电泳法分子大小和分子大小和形状的差异形状的差异凝胶过滤法凝胶过滤法超滤法超滤法透析法透析法离心法离心法亲和力的差异亲和力的差异亲和层析法亲和层析法疏水作用的差异疏水作用的差异疏水层析法疏水层析法分配系数的差异分配系数的差异双水相系统萃取法双水相系统萃取法由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意:1 1全部操作在低温全部操作在低温0 044。2 2在分离提纯过程中，不能剧烈搅
38、拌。在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。3 3在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTAEDTA、少量少量-巯基乙醇及蛋白酶抑制剂。巯基乙醇及蛋白酶抑制剂。4 4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力和质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力和回收率（得率）。回收率（得率）。酶的纯度：酶的纯度：总活力总活力总活力总活力 =活力单位数活力单位数/mL/mL酶液酶液总体积（总体积（mL mL）比活力比活力比活力比活力=活力单位数活力单位数/毫克蛋白毫克蛋白纯化倍数纯化倍数纯化倍数纯化倍数=每次比活力
39、每次比活力第一次比活力第一次比活力产率产率产率产率%（回收率）（回收率）（回收率）（回收率）=100=100每次总活力每次总活力第一次总活力第一次总活力酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、分子筛层析等。电泳法、分子筛层析等。酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性酶的保存酶的保存v低温（低温（04，-20）；高浓度较稳定；加入）；高浓度较稳定；加入稳定剂；固定化。稳定剂；固定化。v最后一步纯化过程得到的酶液，需经浓缩或结最后一步纯化过程得到的酶液，需经浓缩或结晶以及其它处理，以便于保存。在合适的
40、条件晶以及其它处理，以便于保存。在合适的条件下，酶一般可保存较长的时间。下，酶一般可保存较长的时间。在在4下，可下，可将酶悬浮在浓硫酸铵或将酶悬浮在浓硫酸铵或PEG溶液中保存，溶液中保存，10 mg/ml 的浓酶液可加入的浓酶液可加入25%50%甘油保存。甘油保存。可将酶液过滤除菌，以减少微生物降解作用。可将酶液过滤除菌，以减少微生物降解作用。v冷冻干燥（冷冻干燥（04）保存，避免反复冻溶。）保存，避免反复冻溶。v1982 Thomas R Cech1982 Thomas R Cech从四膜虫发现从四膜虫发现rRNArRNA的自身催的自身催化作用，并提出了核酶（化作用，并提出了核酶（riboz
41、ymeribozyme）的概念。）的概念。v核酶的种类核酶的种类催化分子内反应（自我剪接和自我剪切）催化分子内反应（自我剪接和自我剪切）催化分子间反应（催化分子间反应（L19RNAL19RNA、RNaseP)RNaseP)v核酶的研究意义核酶的研究意义v七、核酶（七、核酶（ribozyme)ribozyme)19821982年美国年美国T.CechT.Cech等人发现四膜虫的等人发现四膜虫的rRNArRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现某些工，发现某些RNARNA有催化活性。有催化活性。Thomas Cech Thomas Cech U
42、niversity of Colorado University of Colorado at Boulder,USA at Boulder,USA 19831983年美国年美国S.AltmanS.Altman等研究等研究 E.coli RNaseP E.coli RNaseP（由（由23%23%蛋白质和蛋白质和77%77%的的RNARNA组成），发现组成），发现RNaseP RNaseP 中的中的RNARNA可催化可催化E.coli tRNAE.coli tRNA的前体加工。的前体加工。Sidney Altman Sidney Altman Yale University New Yale
43、University New Haven,CT,USA Haven,CT,USA v抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。v既是抗体又具有催化功能的蛋白质称为既是抗体又具有催化功能的蛋白质称为“抗体酶抗体酶(abzyme)”(abzyme)”。因为它是具有催化活性的抗体；故。因为它是具有催化活性的抗体；故又称为又称为“催化性抗体催化性抗体(catalytic antiboy)”(catalytic antiboy)”。v19861986年年 Bichard Lerner Bichard Lerner和和 Peter Schultz Peter Schultz两个两
44、个小组根据过渡态理论和免疫学原理，运用单克隆小组根据过渡态理论和免疫学原理，运用单克隆抗体技术成功地制备了具有酶活性的抗体，得到抗体技术成功地制备了具有酶活性的抗体，得到了抗体酶。了抗体酶。八、抗体酶（八、抗体酶（abzyme)abzyme)Figure The expected transition states for ester or carbonate hydrolysis reactions.Phosphonate and phosphate compounds,respectively,make good transition-state analogs for these rea
45、ctions.酶工程就是利用酶的特异催化功能，对酶酶工程就是利用酶的特异催化功能，对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术，包括：来生产人类所需产品的一项技术，包括：（1 1）天然酶的开发和生产）天然酶的开发和生产 （2 2）酶的修饰改造）酶的修饰改造 （3 3）酶的固定化技术）酶的固定化技术 （4 4）细胞的固定化技术）细胞的固定化技术 （5 5）酶反应器的研制和应用）酶反应器的研制和应用 （6 6）人工酶）人工酶九、酶工程九、酶工程v通过吸附、偶联、交联和包埋等物理化学方通过吸附、偶联、交联和包埋等物理化学方法将酶做成
46、仍具催化活性的水不溶酶（固相法将酶做成仍具催化活性的水不溶酶（固相酶）。酶）。v与固定化酶技术相配套的是酶生物反应器。与固定化酶技术相配套的是酶生物反应器。一个安装有固定化酶材料的容器就是酶生物一个安装有固定化酶材料的容器就是酶生物反应器，它是把反应物质变成产品的重要生反应器，它是把反应物质变成产品的重要生产车间。产车间。固定化酶固定化酶优点：优点：1.1.可多次使用，且酶的稳定性提高。可多次使用，且酶的稳定性提高。2.2.反应后，酶易与底物和产物分开。反应后，酶易与底物和产物分开。3.3.反应条件易于控制反应条件易于控制 。缺点：缺点：1.1.费用太高。费用太高。2.2.大分子的底物不易使用
47、。大分子的底物不易使用。固定化酶的特点固定化酶的特点固定化酶法生产高果糖浆固定化酶法生产高果糖浆 也称果葡糖浆或异构糖浆，它是以酶法糖也称果葡糖浆或异构糖浆，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆。萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆。v淀粉淀粉 液化、糖化液化、糖化 葡萄糖浆葡萄糖浆 膜过滤膜过滤 浓缩浓缩 异构化异构化 部分变成果糖部分变成果糖（42%）混合混合 浓缩、精制浓缩、精制 55%高果糖高果糖浆浆v参与的酶：参与的酶：-淀粉酶淀粉酶 淀粉葡萄糖苷酶淀粉葡萄糖苷酶 葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶高果糖浆的生产流程高果糖浆的生产流程