《第五章体外分析技术PPT讲稿.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第五章体外分析技术PPT讲稿.ppt（62页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第五章体外分析技术第五章体外分析技术第1页，共62页，编辑于2022年，星期三2定义以放射性核素或其他非放射性物质标记的配以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。物活性物质的检测技术。第2页，共62页，编辑于2022年，星期三3 待测物质浓度与检测手段待测物质浓度与检测手段 临床化学分析临床化学分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLm mg/mLmg/mLg/L免疫分析免疫分析Therapeutic Dr
2、ugsThyroid HormoneFertility HormoneAllergyCancer MarkersInfectious DiseaseVitaminsSerum Proteins常量常量微量微量超微量超微量第3页，共62页，编辑于2022年，星期三4 体外分析技术是结合了放射性核素的高灵体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便度好、应用面广、方法简便等优点。等优点。第4页，共62页，编辑于2022年，星
3、期三方法学基础方法学基础结合反应结合反应n n遵守可逆反应的质量作用定律：遵守可逆反应的质量作用定律：k1,v1R+L RL k2,v2第5页，共62页，编辑于2022年，星期三定量手段定量手段n n放射性测量技术放射性测量技术n n酶定量技术酶定量技术n n化学发光定量技术化学发光定量技术第6页，共62页，编辑于2022年，星期三生物学基础生物学基础n n特异性结合反应：特异性结合反应：特异性结合反应：特异性结合反应：抗原抗原抗原抗原-抗体的免疫结合反应；抗体的免疫结合反应；抗体的免疫结合反应；抗体的免疫结合反应；配基配基配基配基-受体的结合反应；受体的结合反应；受体的结合反应；受体的结合反
4、应；底物底物底物底物-催化酶之间的酶促反应；催化酶之间的酶促反应；催化酶之间的酶促反应；催化酶之间的酶促反应；n n结合体对：结合体对：结合体对：结合体对：抗原抗原抗原抗原-抗体抗体抗体抗体激素激素激素激素-激素结合球蛋白激素结合球蛋白激素结合球蛋白激素结合球蛋白受体受体受体受体-配体配体配体配体第7页，共62页，编辑于2022年，星期三8体外分析技术体外放射分析体外放射分析体外非放射分析体外非放射分析放射性竞争放射性竞争结合分析结合分析放射性非竞放射性非竞争结合分析争结合分析放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析 (radioimmunoassay,RIA)RIA)免疫放射分析免疫
5、放射分析免疫放射分析免疫放射分析酶免疫分析酶免疫分析酶免疫分析酶免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析(immunoradiometric assay,IRMA)IRMA)(EIA)(EIA)(CLIA)(CLIA)(FIA)(FIA)分类:第8页，共62页，编辑于2022年，星期三第第 一一 节节放射免疫分析法放射免疫分析法(Radioimmunoassay)Dr.Yalow 在体外条件下在体外条件下,利用利用Ag与定量的与定量的*Ag对限量的特异性对限量的特异性Ab的竞争的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的
6、量来计算出结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量的一种超微量量的一种超微量分析技术。分析技术。第9页，共62页，编辑于2022年，星期三10基本原理 Ag-Ab +Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab +*Ag(B)(F)4*Ag与与Ag 免疫活性相同免疫活性相同4*AgAg AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg *Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag 90%2）半衰期足够长）半衰期足够长3）保持原有抗原的特性）保持原有抗原的特性大分子：大分子：125I小分子：小分子：3H or 125I第24页，共62页，编辑于2022年，星期三3.非标记抗原非标记抗原 （标准品）（标准
7、品）化学结构、免疫活性与被测抗原相同化学结构、免疫活性与被测抗原相同高纯度高纯度第25页，共62页，编辑于2022年，星期三二、基本方法二、基本方法 B和和F的分离的分离1、第一类、第一类2、第二类、第二类双抗体沉淀法双抗体沉淀法PEG沉淀法沉淀法固相第二抗体法固相第二抗体法+AgAb(1)Ab(2)Ab(2)Ab(1)Ag可溶性复合物可溶性复合物可沉淀复合物可沉淀复合物试管试管试管试管第26页，共62页，编辑于2022年，星期三分离方法的要求分离方法的要求n n分离完全、快速。分离完全、快速。分离完全、快速。分离完全、快速。n n不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不不影响免疫反应的平
8、衡，即是要求在分离过程中不不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原使抗原使抗原使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。抗体复合物解离或形成新的复合物。抗体复合物解离或形成新的复合物。抗体复合物解离或形成新的复合物。n n受环境因素（温度、受环境因素（温度、受环境因素（温度、受环境因素（温度、PHPHPHPH值等）的影响小。值等）的影响小。值等）的影响小。值等）的影响小。n n操作简便，分离剂来源丰富、价廉。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。第27页，共62页，编辑于2022年，星
9、期三三、质量控制三、质量控制（quality controlquality control）1 1、精密度（、精密度（、精密度（、精密度（precisionprecision）变异系数（变异系数（变异系数（变异系数（CV CV）7%10%7%10%2、准确度（、准确度（accuracy）回收率回收率=测定值测定值/真实值真实值100%90%110%3、灵敏度、灵敏度（sensitivity）方法的最小可测量方法的最小可测量4、特异性（、特异性（specificity）交叉反应率交叉反应率5、可靠性（、可靠性（validity）平行性试验平行性试验6、稳定性（、稳定性（stability）B0%
10、，NSB，ED25，ED50，ED75 ABC第28页，共62页，编辑于2022年，星期三 质量控制就是使用合适的方法以检查、表质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。使这种误差降低到某一允许水平。具体作用有：具体作用有：1 1 1 1检查误差的程度，决定测定结果的取舍。检查误差的程度，决定测定结果的取舍。检查误差的程度，决定测定结果的取舍。检查误差的程度，决定测定结果的取舍。2 2 2 2识别误差的来源并消除其原因。识别误差的来源并消除其原因。识别误差的来源并消除其原因。识别误差的来源并
11、消除其原因。3 3 3 3改进测定方法的设计以提高质量。改进测定方法的设计以提高质量。改进测定方法的设计以提高质量。改进测定方法的设计以提高质量。第29页，共62页，编辑于2022年，星期三RIA RIA 小小 结结1.1.灵敏度高灵敏度高2.2.特异性好特异性好3.3.精确的定量精确的定量4.4.方法操作简便方法操作简便第30页，共62页，编辑于2022年，星期三第二节第二节 免疫放射分析法免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab +*Ab（immunoradiometric assay,IRMA）B%Ag（B）（F）在体外在体外,利用利用AgAg与过量的与过量的*AbAb的非竞争性结合反应，通过
12、测定放射性复合物的量来计的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出算出Ag Ag 量。标记抗体，抗体是过量的。量。标记抗体，抗体是过量的。第31页，共62页，编辑于2022年，星期三IRMA与与RIA工作原理的主要区别工作原理的主要区别RIAIRMA竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应采用标记抗原采用标记抗体三种主要反应试剂二种主要反应试剂所用抗体是限量的所用抗体是过量的*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关反应到达平衡慢反应到达平衡快非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响低剂量区低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素第32页，共6
13、2页，编辑于2022年，星期三B%B%拟合的标准曲线拟合的标准曲线拟合的拟合的NSB拟合的标准曲线拟合的标准曲线拟合的拟合的NSBIRMA的标准曲线及非的标准曲线及非特异结合曲线特异结合曲线RIA的标准曲线及非的标准曲线及非特异结合曲线特异结合曲线第33页，共62页，编辑于2022年，星期三IRMAIRMA和和和和RIARIA低剂量区的不确定因素示意图低剂量区的不确定因素示意图低剂量区的不确定因素示意图低剂量区的不确定因素示意图RIA+或或01IRMA+1第34页，共62页，编辑于2022年，星期三非放射性标记免疫分析技术非放射性标记免疫分析技术酶标记免疫分析技术化学发光免疫分析技术时间分辨荧
14、光免疫分析技术第35页，共62页，编辑于2022年，星期三一、酶标记免疫分析技术一、酶标记免疫分析技术一、酶标记免疫分析技术一、酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（就是酶联免疫吸附分析法（就是酶联免疫吸附分析法（就是酶联免疫吸附分析法（EL
15、ISAELISAELISAELISA）。）。）。）。是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。测技术。测技术。测技术。第36页，共62页，编辑于2022年，星期三第37页，共62页，编辑于2022年，星期三 ELISA ELISA ELISA ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与方法是用酶分子标记抗体，进行与方法是用酶分子标记抗体，进行与方法是用酶分子标记抗体，进行与IRMAIRMAIRMAIRMA相似的相似的相似的相似的夹心法免疫反
16、应，反应结束后分离结合部分和游离部分，夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合
17、物的量成正比。酶量又和复合物的量成正比。酶量又和复合物的量成正比。酶量又和复合物的量成正比。常用的酶是常用的酶是常用的酶是常用的酶是辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶，底物是，底物是，底物是，底物是四甲基联苯胺四甲基联苯胺四甲基联苯胺四甲基联苯胺 (TMB)(TMB)(TMB)(TMB)，反应后显黄色。，反应后显黄色。，反应后显黄色。，反应后显黄色。第38页，共62页，编辑于2022年，星期三二、化学发光免疫分析技术二、化学发光免疫分析技术n n化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。射性核素
18、作为示踪物的超微量分析技术。n n化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。第39页，共62页，编辑于2022年，星期三 1.1.化学发光免疫分析化学发光免疫分析 是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。就可以反映复合物的量。常
19、用的化学发光物质是常用的化学发光物质是异鲁米那异鲁米那和和吖啶酯吖啶酯。第40页，共62页，编辑于2022年，星期三 2.2.化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析 和和ELISAELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物的底物-金刚烷金刚烷，使底物发射出光子。，使底物发射出光子。此法光子发射持续时间较长，可靠性比较此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。好。第41页，共62页，编辑于2022年，星期三3.3.电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(略略)4.4.生物发光免疫分析生
20、物发光免疫分析(略略)第42页，共62页，编辑于2022年，星期三三、时间分辨荧光免疫分析技术三、时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassaytime-resolved fluoroimmunoassay）时间分辨荧光免疫分析采用时间分辨荧光免疫分析采用时间分辨荧光免疫分析采用时间分辨荧光免疫分析采用稀土元素稀土元素稀土元素稀土元素标记抗体，利用标记抗体，利用标记抗体，利用标记抗体，利用时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得稀土元素稀土元
21、素稀土元素稀土元素的的的的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。第43页，共62页，编辑于2022年，星期三标记物为具有独特荧光特性的标记物为具有独特荧光特性的稀土金属稀土金属镧系元素镧系元素 镧系元素共有镧系元素共有镧系元素共有镧系元素共有1515种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种:钐（钐（钐（钐（SmSm），铕（），铕（），铕（）
22、，铕（EuEu），镝（），镝（），镝（），镝（DyDy），鋱（），鋱（），鋱（），鋱（TeTe）镧系元素荧光重要特点：镧系元素荧光重要特点：镧系元素荧光重要特点：镧系元素荧光重要特点：1.1.极长的荧光衰退时间极长的荧光衰退时间极长的荧光衰退时间极长的荧光衰退时间 铕：铕：铕：铕：730000ns730000ns，钐：，钐：，钐：，钐：50000ns50000ns，一般荧光物质：，一般荧光物质：，一般荧光物质：，一般荧光物质：10ns10ns 2.200nm 2.200nm的的的的StokesStokes位移位移位移位移 铕：激发光铕：激发光铕：激发光铕：激发光340nm340nm，发射光，发
23、射光，发射光，发射光613nm613nm 荧光素的荧光素的荧光素的荧光素的StokesStokes位移为位移为位移为位移为273nm273nm 3.3.狭窄的发射峰狭窄的发射峰狭窄的发射峰狭窄的发射峰 4.4.解离解离解离解离-增强技术可使其荧光性提高增强技术可使其荧光性提高增强技术可使其荧光性提高增强技术可使其荧光性提高100100万倍万倍万倍万倍第44页，共62页，编辑于2022年，星期三时间分辨荧光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay）一、基本原理一、基本原理镧系元素（镧系元素（1515）：铕（）：铕（EuEu），钐），钐（
24、SmSm），镝（），镝（DyDy），鋱（），鋱（TeTe）Eu+EuEu+增强液增强液+Eu“解离增强镧系荧光免疫分析解离增强镧系荧光免疫分析”第45页，共62页，编辑于2022年，星期三时间分辨荧光检测的基本原理示意图时间分辨荧光检测的基本原理示意图荧光衰退时间荧光衰退时间铕：铕：730000 ns钐：钐：50000 ns一般荧光物质：一般荧光物质：10 ns铕的荧光铕的荧光第46页，共62页，编辑于2022年，星期三二、二、TrFIATrFIA的特点的特点1.最大限度提高测量方法的灵敏度最大限度提高测量方法的灵敏度2.有与有与RIA相似的特异性和精密度相似的特异性和精密度3.可同时测定两种
25、以上的抗原可同时测定两种以上的抗原4.无辐射污染无辐射污染第47页，共62页，编辑于2022年，星期三DELFIA技术的特点为临床检测带来的先进性技术的特点为临床检测带来的先进性技技术术特点特点检验检验先先进进性性时间时间分辨分辨波波长长分辨分辨将特异性将特异性荧荧光与非特异性光与非特异性荧荧光光分离开分离开零背景零背景高特异性高特异性解离解离-增增强强荧荧光性大大提高光性大大提高稳稳定的定的荧荧光螯合物光螯合物线线性范性范围围更更宽宽重复性更好重复性更好低分子量原子低分子量原子标记标记标记标记位点多可达位点多可达20个个对标记对标记物的物的结结构与活性影响小构与活性影响小无衰无衰变变受受环环
26、境影响小境影响小灵敏度更高灵敏度更高高高稳稳定性，高精确度定性，高精确度试剂试剂保保质质期至少一年期至少一年标标准曲准曲线线保留保留时间长时间长同一批次只需两点定同一批次只需两点定标标多多标记标记单单，双，三，四，双，三，四标记标记一个一个试剂试剂盒可同盒可同时测时测多个多个项项目目第48页，共62页，编辑于2022年，星期三总结总结：体外分析的发展体外分析的发展n n方法设计的改变：竞争结合分析方法设计的改变：竞争结合分析 非竞争结合分非竞争结合分析，代表方法是免疫放射分析析，代表方法是免疫放射分析n n标记物的改变：放射性核素标记物的改变：放射性核素 荧光、酶、化学荧光、酶、化学发光、稀土
27、元素发光、稀土元素n n结合体的改变结合体的改变 第49页，共62页，编辑于2022年，星期三 微生物微生物微生物微生物 RMA RMA RMA RMA 酶酶酶酶 REA REA REA REA 受体受体受体受体 RRA RRA RRA RRA 特异结合蛋白特异结合蛋白特异结合蛋白特异结合蛋白 CPBA CPBA CPBA CPBA 改变结合体对改变结合体对改变结合体对改变结合体对放射性技术放射性技术放射性技术放射性技术 Ag Ag-Ab Ag Ag-Ab Ag Ag-Ab Ag Ag-Ab RIA +Ab RIA +Ab RIA +Ab RIA +Ab免疫学技术免疫学技术免疫学技术免疫学技术
28、 AgAgAgAg Ag-AbAg-AbAg-AbAg-Ab 改变标记物改变标记物改变标记物改变标记物第一阶段第一阶段第一阶段第一阶段 第二阶段第二阶段第二阶段第二阶段 第三阶段第三阶段第三阶段第三阶段小分子半抗原联接小分子半抗原联接125125I I单克隆技术单克隆技术固相技术固相技术药品化药品化KitKit理论与实践上更丰富更完善的理论与实践上更丰富更完善的RIARIA1 1.可测物达可测物达300300多种多种2.2.涉及多个临床与基础学科涉及多个临床与基础学科 3 3.RIARIA显像显像 4 4.RIARIA治疗治疗 荧光荧光 FIA IRMA化学发光化学发光 CIA 酶酶 EIA第50页，共62页，编辑于2022年，星期三第51页，共62页，编辑于2022年，星期三第52页，共62页，编辑于2022年，星期三第53页，共62页，编辑于2022年，星期三第54页，共62页，编辑于2022年，星期三第55页，共62页，编辑于2022年，星期三第56页，共62页，编辑于2022年，星期三第57页，共62页，编辑于2022年，星期三第58页，共62页，编辑于2022年，星期三第59页，共62页，编辑于2022年，星期三第60页，共62页，编辑于2022年，星期三第61页，共62页，编辑于2022年，星期三第62页，共62页，编辑于2022年，星期三