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1、第五章体外培养的基本技第五章体外培养的基本技术一、培养操作基本要领和要一、培养操作基本要领和要（一）无菌操作（一）无菌操作防止污染是决定培养成败的首要条件。防止污染是决定培养成败的首要条件。（二）培养前准备（二）培养前准备 操作野消毒操作野消毒 洗手和着装洗手和着装 火焰消毒火焰消毒（三）培养操作：动作要准确敏捷，东西摆放在（三）培养操作：动作要准确敏捷，东西摆放在正确位置，防止污染。正确位置，防止污染。二、基本培养操作技术二、基本培养操作技术（一）取材：（一）取材：含有维持液或含有维持液或BSSBSS的无菌标本瓶的无菌标本瓶 。除去组织表面上的血块和血迹，尤其开除去组织表面上的血块和血迹，尤
2、其开 放性器官来源的组织。放性器官来源的组织。超净工作台内进行操作。超净工作台内进行操作。1cm31cm3组织块。组织块。取材后立即培养，否则取材后立即培养，否则44保存，以不超保存，以不超 过过6h 6h 为宜。为宜。（二）组织的分离（二）组织的分离原则：原则：获取单细胞获取单细胞同时尽可能不损伤细胞同时尽可能不损伤细胞常用方法常用方法机械法化学法1离心分离法：离心分离法：适用于血液、羊水、胸腹水细适用于血液、羊水、胸腹水细胞的培养。胞的培养。注意：低速离心，通常低速离心，通常5001000rpm/min，510min.悬液量大时，离心时间悬液量大时，离心时间适当延长。适当延长。淋巴细胞分层
3、液适用于分离血中淋巴细胞。淋巴细胞分层液适用于分离血中淋巴细胞。利用各种血细胞比重不同，使各类细胞相利用各种血细胞比重不同，使各类细胞相互分开。互分开。微量全血法微量全血法LC培养时，不必进行培养时，不必进行LC分离。分离。根据组织种类和培养要求，采用相应的分离手段：根据组织种类和培养要求，采用相应的分离手段：2切割分离法：用眼科剪剪切或手术刀切割。切割分离法：用眼科剪剪切或手术刀切割。组织块培养时，剪切成组织块培养时，剪切成1mm3大小的组织块。大小的组织块。所取组织多为所取组织多为1cm3，注意用，注意用Hanks液漂洗。液漂洗。3机械分散法：机械分散法：挤压法：适用于软组织（如脑组织），
4、用注挤压法：适用于软组织（如脑组织），用注射器粉碎组织。射器粉碎组织。不不锈锈钢钢纱纱网网（1mm、100m、20m网网眼眼）压压取取法法：仅仅适适用用于于处处理理软软组组织织，对对较较硬硬组组织织和和纤纤维维组组织效果不好，网眼越小对组织的损伤越大。织效果不好，网眼越小对组织的损伤越大。4.消化分离法：消化分离法：在把组织剪切成较小体积的基础上，应在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散小块组织的方用生化和化学手段进一步分散小块组织的方法法最终使被处理的组织分散成最终使被处理的组织分散成细胞团或单细胞团或单个细胞个细胞制成制成细胞悬液细胞悬液进一步培养。进一步培养。（1）
5、胰蛋白酶消化法：）胰蛋白酶消化法：与胰酶不同（胰酶除蛋白酶外，与胰酶不同（胰酶除蛋白酶外，还还 包括淀粉酶和脂肪酶）包括淀粉酶和脂肪酶）适用于消化细胞间质较少的软组织适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、上皮组织、肝、肾等如胚胎组织、上皮组织、肝、肾等 组织；组织；对对单层细胞单层细胞的作用也较好，适用于细的作用也较好，适用于细 胞传代。胞传代。对纤维性组织和较硬的癌组织的消化作用对纤维性组织和较硬的癌组织的消化作用较差。较差。Ca2+、Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定的对胰蛋白酶的活性有一定的抑抑制制作用，故需用作用，故需用D-Hanks液配制。液配制。血清可抑制胰蛋白酶的活性血清可抑制
6、胰蛋白酶的活性，因此细胞传，因此细胞传代时，用胰蛋白酶消化细胞后，不必用代时，用胰蛋白酶消化细胞后，不必用Hanks冲洗。冲洗。两种消化方法两种消化方法温消化：温消化：37，30min1h冷消化：冷消化：4，1220h胰蛋白酶消化细胞法如下：胰蛋白酶消化细胞法如下：剪切：在去除不需要的组织后，使用无钙镁的平衡盐溶液清洗剪切：在去除不需要的组织后，使用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织块，重复清洗组织块，重复清洗2到到3次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成1-2mm3小块。小块。把组织块置入容器内，加入比组织量多把组织块置入容器内，加入比组织量多3050倍的倍的0.25的
7、胰的胰蛋白酶（预温至蛋白酶（预温至37）。消化：消化：3737水浴或温箱中消化水浴或温箱中消化303060min，每隔，每隔510min摇动摇动1次；次；或或在在4孵育孵育12到到20小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进去去消化完毕，移入离心管中，消化完毕，移入离心管中，800转转/分分离心离心68min，吸除上清液吸除上清液Hanks液漂洗液漂洗23min，离心去上清，两次，离心去上清，两次800转转/分分离心离心5min，去上清，加入一定量营养液，去上清，加入一定量营养液，通过无菌不锈钢丝通过无菌不锈钢丝网（网（100-200目）过滤，计数和接种细胞，进行培养目）过滤，
8、计数和接种细胞，进行培养（2）胶原酶（）胶原酶（Collagenase）消化法：）消化法：Collagenase是是一一种种由由细细菌菌提提取取出出的的酶酶，适适用用消消化化纤纤维维组组织织、癌癌组组织织和和上上皮皮组组织织。消消化化作作用缓和，无需振荡。用缓和，无需振荡。使使用用浓浓度度200u/ml或或0.10.3mg/ml，可可与与胰蛋白酶混合应用胰蛋白酶混合应用。用无菌解剖刀和剪子把漂洗干净的组织切成用无菌解剖刀和剪子把漂洗干净的组织切成1-5mm3小块，移入培养瓶小块，移入培养瓶中，加入一定量培养液，再中，加入一定量培养液，再加入胶原酶，终浓度为加入胶原酶，终浓度为200u/ml37
9、孵育孵育448小时；如消化缓慢可延长到小时；如消化缓慢可延长到35天，无需摇动，可天，无需摇动，可换液换液1次次如见组织块变软，散于瓶底，振荡后即散成细胞团和单个细胞，取培养如见组织块变软，散于瓶底，振荡后即散成细胞团和单个细胞，取培养液低速离心液低速离心5min，去上清；重悬于，去上清；重悬于BSS中，再中，再低速离心低速离心5min，去上清，去上清胶原酶消化过程如下：加入新培养液制成细胞悬液，计数后，接种进行培养加入新培养液制成细胞悬液，计数后，接种进行培养TrypsinCollagenase消化特性消化特性适应于消化软组织适应于消化软组织消化纤维多的组织消化纤维多的组织使用浓度使用浓度0
10、.010.5%0.10.3g/ml消化时间消化时间0.52h112hpH896.57.0作用强度作用强度强烈强烈缓和缓和细胞影响细胞影响时间过长有影响时间过长有影响无大影响无大影响血清抑活血清抑活有有无无Ca2+和和Mg2+有影响有影响无影响无影响(3)EDTA消化法：消化法：非酶性消化物，用无非酶性消化物，用无Ca2+、Mg2+液体配制成液体配制成0.02%的工作液。的工作液。螯合组织生存环境中的螯合组织生存环境中的Ca2+、Mg2+，促进细胞相互，促进细胞相互分离。分离。与胰蛋白酶按与胰蛋白酶按1：1或或2：1比例混合使用，消化作用更好比例混合使用，消化作用更好 EDTA消化细胞后，一定要
11、用消化细胞后，一定要用Hanks液冲洗干净，因培液冲洗干净，因培养环境中残留的养环境中残留的EDTA对细胞生长有不良影响。对细胞生长有不良影响。作用比胰蛋白酶缓和，作用比胰蛋白酶缓和，消化传代细胞，不用来消化新鲜消化传代细胞，不用来消化新鲜组织组织。（三）细胞计数法（三）细胞计数法以细胞数以细胞数/毫升表示毫升表示1细胞活力检查：细胞活力检查：0.4%TrypanBlue（台盘蓝）（台盘蓝）与细胞悬液按与细胞悬液按1：10比例混合，健康的活细比例混合，健康的活细胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均为不健康细胞。为不健康细胞。2 2细胞计数：细胞计数：如偶见由
12、两个以上细胞组成的细胞团，按单如偶见由两个以上细胞组成的细胞团，按单个细胞计算，若细胞团数个细胞计算，若细胞团数10%，说明消化不充分，说明消化不充分，细胞数少于细胞数少于200个个/10mm2或大于或大于500个个/10mm2说明说明稀释不当。稀释不当。3.结果分析结果分析 细胞死亡后，细胞膜通透性增加，台盘蓝进入细细胞死亡后，细胞膜通透性增加，台盘蓝进入细胞，导致细胞蓝染。胞，导致细胞蓝染。台盘蓝染色法是一种台盘蓝染色法是一种粗略检测粗略检测细胞存活的方法，细胞存活的方法，不能准确反映细胞活力差异。不能准确反映细胞活力差异。细胞活力（细胞活力（%）（总细胞数着色细胞数）（总细胞数着色细胞数
13、）总细胞数总细胞数100%4.注意事项注意事项：含有台盘蓝的细胞悬液不宜放置时间：含有台盘蓝的细胞悬液不宜放置时间过长，否则正常细胞可摄取染料，影响染色结果。过长，否则正常细胞可摄取染料，影响染色结果。(三三)细胞冻存细胞冻存1原理：不附加任何条件下，直接冻存细胞原理：不附加任何条件下，直接冻存细胞时，细胞内外环境的水会结成冰晶，时，细胞内外环境的水会结成冰晶，能导致细胞发生一系列变化，如机能导致细胞发生一系列变化，如机械损伤、电解质升高，渗透压改变、械损伤、电解质升高，渗透压改变、脱水和脱水和PH改变等改变等细胞死亡。细胞死亡。如向细胞培养液中加入保护剂如向细胞培养液中加入保护剂甘油甘油或或
14、DMSO，可可使冰点降低使冰点降低，在缓慢冻结条件下，能使，在缓慢冻结条件下，能使细胞内细胞内水分在冻结前渗出细胞外水分在冻结前渗出细胞外，避免细胞损伤。，避免细胞损伤。2.材料材料仪器设备：液氮罐、超低温冰箱（仪器设备：液氮罐、超低温冰箱（-7085）冻存管：容量为冻存管：容量为12ml消化液：消化液：0.25%胰蛋白酶或与胰蛋白酶或与0.02%EDTA混合混合的消化液的消化液冻存液冻存液:培养液、培养液、FBS和和DMSO或甘油或甘油待冻存细胞待冻存细胞3注意：注意：（1）细胞在）细胞在-50最易受损最易受损（2）为保存细胞最大存活率，一般都采用）为保存细胞最大存活率，一般都采用慢冻快融慢
15、冻快融的的方法，掌握好冻存速度。标准的冷冻速度为方法，掌握好冻存速度。标准的冷冻速度为-1-12/分钟；当温度下降到分钟；当温度下降到-25时，下降速度可增至时，下降速度可增至-5-10/分钟；到分钟；到-100时可迅速冻入液氮中。时可迅速冻入液氮中。（3）冻存一年后，应再复苏培养）冻存一年后，应再复苏培养1次，然后继续冻存。次，然后继续冻存。（4）待冻存细胞应具有较高的活力，即处于对数生长）待冻存细胞应具有较高的活力，即处于对数生长期的细胞。期的细胞。（5）常温下）常温下DMSO对细胞有毒副作用，因此冻存液需对细胞有毒副作用，因此冻存液需在在4下放置下放置4060min后使用。后使用。4冻存
16、程序：冻存程序：选取对数生长期细胞（收集前选取对数生长期细胞（收集前24h换液换液1次）次）离心去上清，加细胞冻存液离心去上清，加细胞冻存液密封密封,放入液氮，标明细胞名称、存放日期放入液氮，标明细胞名称、存放日期分装入分装入2ml无菌螺口冷冻管，每管无菌螺口冷冻管，每管1.5ml细胞悬液细胞悬液细胞计数：常规法制成细胞悬液（细胞计数：常规法制成细胞悬液（107/ml）（四）细胞的复苏四）细胞的复苏自液氮中取出细胞冻存管，迅速放入自液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37水浴水浴离心管吹打、漂洗，离心管吹打、漂洗，5001000rpm离心离心5min吸出细胞悬液，补加吸出细胞悬液，补加10ml细胞培
17、养液细胞培养液again加适量培养液稀释（加适量培养液稀释（1：10或或1：20），分装），分装细胞培养瓶细胞培养瓶（细胞密度（细胞密度5105个个/ml）37，次日换液，次日换液【结果分析结果分析】1.细胞存活率细胞存活率用台盘蓝染色法检测复苏细胞用台盘蓝染色法检测复苏细胞的活性，细胞存活率（的活性，细胞存活率（%）未着色细胞未着色细胞总计总计数细胞数细胞100%2.复苏效果取决于复温速度。复苏效果取决于复温速度。【注意事项注意事项】1.必须在必须在12min内使冻存液完全融化，如果内使冻存液完全融化，如果复温速度太慢，则会造成细胞损伤。复温速度太慢，则会造成细胞损伤。2.注意防护注意防护复
18、苏后细胞复苏后细胞培养培养24h培养培养48h（四）细胞运送（四）细胞运送两种方法两种方法1.液氮或干冰保存，由于二者蒸发较快，用小液氮或干冰保存，由于二者蒸发较快，用小液氮罐较麻烦，只适于空运。液氮罐较麻烦，只适于空运。2.充液法充液法：80%90%细胞汇合时，换新培养液。细胞汇合时，换新培养液。到本实验室后，留正常量培养液，到本实验室后，留正常量培养液，37培培养，液体分批用。养，液体分批用。二、常规细胞培养法二、常规细胞培养法天然培养基培养法：取自动物体内天然天然培养基培养法：取自动物体内天然成分培养细胞。成分培养细胞。人工合成培养基培养法：合成培养基成人工合成培养基培养法：合成培养基成
19、分清楚，便于分析和人工调控。分清楚，便于分析和人工调控。合合成成培培养养基基单单细细胞胞培培养养为为近近代代主主要要的的培培养方法。养方法。特点：特点：组织和细胞刚刚离体，生物学性状尚未发生很大变化，具有组织和细胞刚刚离体，生物学性状尚未发生很大变化，具有二倍体遗传性状。二倍体遗传性状。在供体来源充分、生物条件稳定情况下（年龄、性别），在在供体来源充分、生物条件稳定情况下（年龄、性别），在一定程度上能反映体内状态，适于做药敏试验。一定程度上能反映体内状态，适于做药敏试验。初代培养所有机能上的改变，主要是表型上的改变，不一定初代培养所有机能上的改变，主要是表型上的改变，不一定是体细胞突变。是体细
20、胞突变。初代培养细胞是研究基因表达的理想系统。初代培养细胞是研究基因表达的理想系统。是建立各种细胞系（株）的必经阶段。是建立各种细胞系（株）的必经阶段。异质性，初代培养的组织由多种细胞混合形成，在分析细胞异质性，初代培养的组织由多种细胞混合形成，在分析细胞生物特性时有一定困难。生物特性时有一定困难。（一）原代培养法：（一）原代培养法：又称初代培养，是从供体获取组织又称初代培养，是从供体获取组织后的首次培养。后的首次培养。1.消化培养法消化培养法 主要用品：主要用品：人或动物的新鲜组织人或动物的新鲜组织0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶Hanks液液含含10%20%牛血清的培养液牛血清的培养液眼科剪刀、
21、眼科镊眼科剪刀、眼科镊吸管、培养皿、瓶和不锈钢筛网、计数板等。吸管、培养皿、瓶和不锈钢筛网、计数板等。初代细胞培养主要方法：初代细胞培养主要方法：l流程：（注意流程：（注意无菌操作无菌操作）15cm3新鲜组织用新鲜组织用Hanks液漂洗液漂洗23次次眼科剪将组织剪成约眼科剪将组织剪成约1mm3的小块的小块加加3050倍原组织块的倍原组织块的0.25%胰蛋白酶液胰蛋白酶液温消化温消化37，14h或或冷消化冷消化4，624h不锈钢网滤过除去大块组织不锈钢网滤过除去大块组织所得细胞悬液所得细胞悬液5001000rpm低速离心，低速离心，5min弃上清，加适量营养液（含血清），吹弃上清，加适量营养液（
22、含血清），吹打均匀制成细胞悬液打均匀制成细胞悬液计数（计数（5105个个/ml），细胞密度过大），细胞密度过大时，补加营养液调整时，补加营养液调整37培养，注意培养，注意PH值（值（7.27.4）冷消化冷消化例：例：乳鼠肾细胞原代培养乳鼠肾细胞原代培养 （1 1）准备工作：）准备工作：培养用品消毒后，放在超净工作台内培养用品消毒后，放在超净工作台内 紫外线消毒，做好各项准备工作紫外线消毒，做好各项准备工作.点燃酒精灯，用品按布局放置，安装点燃酒精灯，用品按布局放置，安装 吸管等吸管等 采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死 将小鼠放入盛有将小鼠放入盛有70%酒精的
23、烧杯中数秒酒精的烧杯中数秒 置超净工作台内置超净工作台内（二）取材：二）取材：打开消毒器械包打开消毒器械包 用镊子掀起乳鼠腹部皮用镊子掀起乳鼠腹部皮肤肤,用解剖剪剪开腹腔用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔。充分暴露腹腔。用另一镊子轻轻夹起肠管用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧翻置一侧,充充分暴露位于腹腔背壁脊柱。分暴露位于腹腔背壁脊柱。取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中 用吸管吸取用吸管吸取PBS加入培养皿中，清洗肾脏加入培养皿中，清洗肾脏3次，尽量去掉血污。次，尽量去掉血污。将肾组织用解剖剪剪成几块，再用将肾组织用解剖剪剪成几块，再用PBS漂漂洗，洗净血液为止洗，洗净血液
24、为止。（3 3）胰蛋白酶消化：）胰蛋白酶消化：将洗净的组织块移入消毒小瓶中，用眼科剪剪切至将洗净的组织块移入消毒小瓶中，用眼科剪剪切至0.5mm大小的组织块。大小的组织块。加入加入1020倍体积的倍体积的0.25%胰蛋白酶，放入胰蛋白酶，放入37水浴中水浴中消化消化3060分钟，注意应每隔分钟，注意应每隔1015分钟振摇分钟振摇1次。次。当组织块变得疏松，颜色略白时，取出置于超净工作台当组织块变得疏松，颜色略白时，取出置于超净工作台内用吸管反复吹打组织块，使大部分组织块分散成细胞团内用吸管反复吹打组织块，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态。或单个细胞状态。加入加入12ml培养液终止消化，
25、净置片刻，让未消化完的培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉，将上部的组织悬液移入无菌离心管中。组织块自然下沉，将上部的组织悬液移入无菌离心管中。（4 4）离心及计数）离心及计数 以以8001000r/min低速离心低速离心810min，超，超净工作台内开盖，取上清加入适量培养液，细净工作台内开盖，取上清加入适量培养液，细胞计数后分装。胞计数后分装。在细胞瓶（板）上标明细胞名称，代数，在细胞瓶（板）上标明细胞名称，代数，日期。日期。倒置显微镜下观察细胞分散情况后置倒置显微镜下观察细胞分散情况后置37培养箱中培养。培养箱中培养。（5）细胞观察）细胞观察 培养细胞每天观察，检查：培养
26、细胞每天观察，检查：A.污染与否污染与否?B.细胞生长状态细胞生长状态 如见培养液变为黄色且又混浊，为污染；如培养液为如见培养液变为黄色且又混浊，为污染；如培养液为桔红色，表明细胞状况良好。在无污染时，桔红色，表明细胞状况良好。在无污染时，4h内有细胞贴内有细胞贴壁，圆形悬浮状的细胞延展成多角型。壁，圆形悬浮状的细胞延展成多角型。培养培养34天，细胞生长繁殖，可见细胞岛形成。细胞天，细胞生长繁殖，可见细胞岛形成。细胞透明，颗粒少，界限清。透明，颗粒少，界限清。由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时应换液。液逐
27、渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时应换液。胰蛋白酶消化培养法特点：胰蛋白酶消化培养法特点：能把组织块分散成细胞团或单个细胞，便于细能把组织块分散成细胞团或单个细胞，便于细胞从培养液中摄取营养和排出代谢产物，细胞能胞从培养液中摄取营养和排出代谢产物，细胞能较快长成单层。较快长成单层。尤其适用于培养大量组织，细胞产量高。尤其适用于培养大量组织，细胞产量高。用于经常性小量培养工作稍显繁琐，易污染。用于经常性小量培养工作稍显繁琐，易污染。2 2组织块培养法组织块培养法 不用消化液不用消化液 尽可能剪碎尽可能剪碎 两种技术：两种技术：翻转干涸法（翻转干涸法（37温箱中）温箱中）薄层营养液培养法薄层营养液培养
28、法2h（不超过（不超过4h)小块相互距离以小块相互距离以0.5cm为宜为宜37加入培养液少许小结小结动物细胞的培养步骤：动物细胞的培养步骤：切取拟培养的动物器官或大组织块切取拟培养的动物器官或大组织块洗去血污洗去血污剔除多余成分剔除多余成分切成约切成约1mm3大小的组织块大小的组织块将所有组织剪碎将所有组织剪碎用于组织培养用于组织培养蛋白酶溶液消化蛋白酶溶液消化机械方法吹打组织块机械方法吹打组织块离心、培养液悬浮离心、培养液悬浮计数、调节细胞密度计数、调节细胞密度用于分离细胞培养用于分离细胞培养（二）传代培养法：（二）传代培养法：细胞达到细胞达到80%以上汇合或刚汇合以上汇合或刚汇合时是理想的
29、时是理想的传代阶段。传代阶段。1.1.用品：用品：80%以上汇合单层细胞以上汇合单层细胞0.25%胰蛋白酶或胰蛋白酶或0.02%EDTAHanks液液细胞培养液细胞培养液培养瓶培养瓶吸管吸管2 2流程：流程：弃去细胞培养瓶中旧营养液弃去细胞培养瓶中旧营养液加适量消化液加适量消化液胞质回缩，细胞间隙增大时终止消化胞质回缩，细胞间隙增大时终止消化弃去消化液，加弃去消化液，加Hanks液轻洗单层细胞液轻洗单层细胞用吸管吸取营养液轻轻吹打瓶壁细胞，使用吸管吸取营养液轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落制成单细胞悬液之脱落制成单细胞悬液分装细胞培养瓶，分装细胞培养瓶，37，CO2培养箱培养培养箱培养3 3注意注意
30、：掌掌握握好好传传代代时时机机，80-90%左左右右汇汇合合最最好好（过早细胞数量少；过晚细胞健康状态不佳）（过早细胞数量少；过晚细胞健康状态不佳）消消化化时时间间适适度度（过过短短细细胞胞不不易易从从瓶瓶壁壁脱脱落落；过长细胞脱落流失受影响）过长细胞脱落流失受影响）消化液浓度要适宜消化液浓度要适宜不同细胞对消化液的反应不同不同细胞对消化液的反应不同三、特殊培养法三、特殊培养法1 1二倍体细胞培养法：二倍体细胞培养法：是指培养的细胞是指培养的细胞始终维持二倍体生物学性状始终维持二倍体生物学性状的培养方法。的培养方法。正常细胞的原代培养即为二倍体细胞，但正常细胞的原代培养即为二倍体细胞，但长期旺
31、盛地增殖生长，并保持二倍体性状并非长期旺盛地增殖生长，并保持二倍体性状并非易事。易事。种细胞种细胞（stock）冻存细胞冻存细胞（stock-2）使用细胞使用细胞冻存细胞冻存细胞（stock-1）使用细胞使用细胞使用细胞使用细胞冻存细胞冻存细胞（stock-2）冻存冻存使用使用冻存冻存使用使用冻存冻存使用使用冻存冻存使用使用低温冻存：低温冻存：措施：措施：采用妥善的培养方法：采用妥善的培养方法：严格控制严格控制PH，最好在，最好在5%CO2培养箱中培养。培养箱中培养。换液时间间隔不能太长，部分换液。换液时间间隔不能太长，部分换液。掌握好传代时机，传代期不能过长，细胞不能掌握好传代时机，传代期不
32、能过长，细胞不能过于密集，应及时传代。过于密集，应及时传代。高质量血清和培养基，尽量维持不变。高质量血清和培养基，尽量维持不变。每次传代均一分为二（细胞数量、营养液量、每次传代均一分为二（细胞数量、营养液量、培养瓶空间和面积不变）进行培养。培养瓶空间和面积不变）进行培养。传代后细胞如不用于实验，立即低温冻存。传代后细胞如不用于实验，立即低温冻存。2加支持物培养法：加支持物培养法：预先向培养容器内加入各预先向培养容器内加入各种可使细胞贴附的支持物，进行培养的方法。种可使细胞贴附的支持物，进行培养的方法。（1）玻璃片：便于进行各种固定、染色处理）玻璃片：便于进行各种固定、染色处理和观察。和观察。盖
33、玻片做支持物的处理：自来水浸泡盖玻片做支持物的处理：自来水浸泡24h96%酒精酒精3060min蒸馏水浸泡蒸馏水浸泡3060min干净软布擦干净干净软布擦干净装入装入培养皿培养皿高压灭菌备用高压灭菌备用（2）聚四氟乙烯）聚四氟乙烯：适于做电镜技术，可以进行：适于做电镜技术，可以进行 包埋和切片。包埋和切片。特点：特点：（1）可在任何时间取出支持物，做各）可在任何时间取出支持物，做各种观察和实验。种观察和实验。（2）需将支持物处理干净，不残留任）需将支持物处理干净，不残留任何对细胞有害成分，避免不利因素影响细何对细胞有害成分，避免不利因素影响细胞贴附和生长。胞贴附和生长。3单细胞分离培养（又称细
34、胞克隆）单细胞分离培养（又称细胞克隆）即把即把单个细胞单个细胞从群体内分离出来从群体内分离出来单独培养单独培养，使之，使之重新繁衍成一个重新繁衍成一个新的细胞群体新的细胞群体的培养技术。的培养技术。细胞经克隆后，形成细胞经克隆后，形成纯系纯系，称细胞株称细胞株。要点和原理要点和原理 细胞群体细胞群体单细胞培养单细胞培养新的细胞群体新的细胞群体纯系纯系 基本原则基本原则：保证分离出的细胞保证分离出的细胞确为一个确为一个而而不是两个或更多。不是两个或更多。理论上各种培养细胞都可进行克隆培养，但原理论上各种培养细胞都可进行克隆培养，但原代培养细胞和有限细胞系（二倍体细胞）较困难，而代培养细胞和有限细
35、胞系（二倍体细胞）较困难，而无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞则较容易。无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞则较容易。细胞对营养液的细胞对营养液的同化作用同化作用，具有，具有促克隆细胞生长促克隆细胞生长作用。作用。不同细胞同化营养液的能力不同。不同细胞同化营养液的能力不同。对培养环境适应性强和具有较强独立生存能力的细胞均对培养环境适应性强和具有较强独立生存能力的细胞均易做细胞克隆。易做细胞克隆。克隆细胞时，要把细胞制备成克隆细胞时，要把细胞制备成单细胞悬液单细胞悬液，再接种到底，再接种到底物上进行培养，让细胞物上进行培养，让细胞单独生长单独生长。适应性大和活力好的细胞能增殖形成细胞小群（适应性大和活
36、力好的细胞能增殖形成细胞小群（Colony)克隆。克隆。原理：原理：无限细胞系，不低于无限细胞系，不低于10%；原代细胞、有限细胞系，原代细胞、有限细胞系，0.55%。ColoningEfficiency克隆形成率克隆形成率（ColoningEfficiency）：）：细胞群中细胞群中单个细胞单个细胞形成克隆的百分数形成克隆的百分数称克隆形成率，也称称克隆形成率，也称接种率接种率（SeedingEfficiency)。用于表示细胞生活力和独立。用于表示细胞生活力和独立生长能力。生长能力。克隆形成率与细胞的密度成正比克隆形成率与细胞的密度成正比培养基：培养基：自制自制适应性培养基适应性培养基是一
37、种是一种不含不含细胞细胞而已被细胞生活过或同化过的培养基。而已被细胞生活过或同化过的培养基。选取同源选取同源指数生长期指数生长期细胞细胞（半汇合）（半汇合）换培养液换培养液1次次继续培养继续培养2448h后，吸取所有培养液后，吸取所有培养液3000-4000rpm，离心，离心10min 提高克隆形成率的措施提高克隆形成率的措施上清用上清用0.22m微孔滤膜过滤（避免形成假克微孔滤膜过滤（避免形成假克隆）隆），低温冻存备用，低温冻存备用用时取用时取1份适应性培养基份适应性培养基+2份新份新配制培养基混合使用配制培养基混合使用血清：胎牛血清血清：胎牛血清小牛血清小牛血清马血清，灭马血清，灭活处理活
38、处理56，0.5h.应先做克隆形成率实验，选最佳者使用。应先做克隆形成率实验，选最佳者使用。激素：含激素：含110u/ml的胰岛素培养液能促进很多的胰岛素培养液能促进很多细胞克隆的形成。细胞克隆的形成。CO2：CO2对绝大多数细胞克隆形成率都有提高，对绝大多数细胞克隆形成率都有提高，多用多用5%，成纤维细胞和胶质细胞，成纤维细胞和胶质细胞2%.饲细胞（饲细胞（Feedercells）：也称滋养细胞，是一层）：也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。细胞附着底物的细胞层。失去分裂能力，但仍然失去分裂能力，但仍然
39、生存并有同化营养液的能力生存并有同化营养液的能力。饲细胞制备后三周内即死亡，应及时应用。饲细胞制备后三周内即死亡，应及时应用。饲饲养养层层克克隆隆培培养养适应性底物：适应性底物：无限细胞系无限细胞系塑料底物；塑料底物；原代培养细胞原代培养细胞胶原层或血浆纤维蛋白层。胶原层或血浆纤维蛋白层。病毒转化细胞或恶性细胞病毒转化细胞或恶性细胞琼脂层（琼脂层（2%），），恶变细胞或恶性转化细胞在软琼脂（恶变细胞或恶性转化细胞在软琼脂（1.2%）中的）中的生长与致瘤性有很大一致性。生长与致瘤性有很大一致性。方法（多孔塑料培养板单细胞克隆法）：方法（多孔塑料培养板单细胞克隆法）：48孔或孔或96孔塑料细胞培养
40、板孔塑料细胞培养板（培养（培养612h后）镜下检测每孔所含后）镜下检测每孔所含细胞数，标记下含单细胞孔细胞数，标记下含单细胞孔制备低密度的细胞悬液（制备低密度的细胞悬液（10个细胞个细胞/ml）每孔接种每孔接种100l细胞悬液细胞悬液37培养培养标记孔细胞增殖成群即为细胞克隆标记孔细胞增殖成群即为细胞克隆继续培养继续培养3-4周，待孔内细胞增至周，待孔内细胞增至500-600个个时，进行分离培养时，进行分离培养扩大再培养扩大再培养注意事项：注意事项：确为一个细胞确为一个细胞后方可进行标记后方可进行标记 注意观察孔底边缘部位注意观察孔底边缘部位 选健康细胞的孔标记选健康细胞的孔标记细胞克隆培养的
41、其他方法细胞克隆培养的其他方法:软琼脂培养、软琼脂培养、甲基纤维素半固体培养、有限稀释法甲基纤维素半固体培养、有限稀释法4悬浮培养法悬浮培养法：使贴附性细胞呈悬浮状态：使贴附性细胞呈悬浮状态生长。生长。悬浮生长型：离心去除旧培养液悬浮生长型：离心去除旧培养液添加添加新培养液新培养液混匀分装即可混匀分装即可贴附生长型：干扰细胞贴附，方可形成贴附生长型：干扰细胞贴附，方可形成悬浮生长状态。悬浮生长状态。常用方法：常用方法：a.大培养瓶增加含有铁芯的无毒聚大培养瓶增加含有铁芯的无毒聚苯乙烯棒，培养中进行电磁搅拌。苯乙烯棒，培养中进行电磁搅拌。b.试管培养细胞，把试管置入带有试管培养细胞，把试管置入带
42、有悬转鼓的温箱中培养。悬转鼓的温箱中培养。5.5.球体细胞培养球体细胞培养 能使培养细胞长成球体型，球体中心部细胞吸收能使培养细胞长成球体型，球体中心部细胞吸收营养和排出代谢产物要通过外围细胞，周边部细胞却营养和排出代谢产物要通过外围细胞，周边部细胞却是直接的，两者生存条件不同，是直接的，两者生存条件不同，与肿瘤组织和体内上与肿瘤组织和体内上皮组织情况相似皮组织情况相似，对研究细胞分化很有价值。，对研究细胞分化很有价值。6.6.微载体细胞培养法微载体细胞培养法 可获得大量细胞。目前使用的载体主要有三种类可获得大量细胞。目前使用的载体主要有三种类型，都是带有不同基团的葡萄糖交联而成的大分子，型，都是带有不同基团的葡萄糖交联而成的大分子，分别为分别为、型。对细胞无毒性，适于各种附着型。对细胞无毒性，适于各种附着型细胞的生长，尤其是附着性差和存活率低的细胞。型细胞的生长，尤其是附着性差和存活率低的细胞。谢谢大家！