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1、1第五章 体外放射分析技术In Vitro Radioassay2定义与分类一、定义：体外放射分析技术是利用核射线对体内的各种生物活性物质进行体外定量分析的各种方法。二、分类：1、竞争性体外放射分析法（如RIA）2、非竞争性体外放射分析法（如IRMA）3、由体外放射分析技术派生出来的非放射性标记免疫分析技术3第一节 放射免疫分析法radioimmunoassay，RIA n1959年，美国的两位科学家Berson和Yalow首次将示踪技术的高度灵敏性和免疫学抗原-抗体结合的高度特异性结合起来，创立了放射免疫分析技术，开创了生物活性物质微量测定技术的新时代。RIA 的特点：灵敏度高、特异性强、准
2、确度高、稳定性好。经不断改进，现在广泛应用于临床检测和科学研究的很多领域。4一、基本原理n放射免疫分析法的基本原理是竞争性抑制，被测量的微量物质Ag（未标记抗原）和标记有放射性核素的该种物质*Ag(标记抗原)对其抗体Ab有相同的结合能力，在反应系统中，Ag和 一定量的*Ag竞争有限量的Ab，反应遵循质量作用定律，即Ag和*Ag与Ab结合的量取决于Ag和*Ag的浓度比例。生成的*AgAb的量随Ag的增加而减少，它们是负相关的关系，即Ag抑制*Ag与Ab的结合，反之*Ag也抑制Ag与Ab的结合。反应达到平衡后，分离*AgAb（B）与*Ag（F），B、F或B/F与Ag的量呈函数关系，利用这一函数关系
3、求出待测抗原的的浓度。6具体方法 用一系列浓度已知的标准抗原（浓度递增的标准品）在严格相同的条件下与一定量的*Ag和有限量的Ab共同反应，反应达到平衡后，分离B与F，测定B的放射性做为纵坐标，以每一反应管的标准品浓度为横坐标，绘成标准曲线。根据被测抗原试管中的B的CPM值在标准曲线上求出该抗原的浓度7函数式8标准曲线10二、基本方法n（一）基本试剂 放射免疫分析反应需要三种基本试剂：1、标准品（非标记标准抗原）2、标记抗原 3、抗体111、标准品n 标准品是样品定量的基础，它的质和量的变化直接影响待测样品的测定值。n 对标准品的要求如下：1）标准品和待测样品应属于同一种物质；2）在与抗体反应时
4、，标准品和待测样品应有相同的活性和亲和能力；3）高度纯化，不含有影响分析的杂质；4）对标准品的定量一定要精确133、抗体n在放射免疫分析中，抗体质量的好坏是影响放射免疫分析的关键因素之一。n高质量的抗体必须具备三个条件：高亲和力、高特异性、高滴度152）高特异性n抗体必须与反应系统中抗原以外的物质尤其是抗原类似物结合得少，以免影响分析结果n抗体特异性的测定：方法：测抗体的交叉反应率 交叉反应率越小，抗体的特异性越高163）高滴度n滴度 是抗体实际应用时的稀释倍数 抗体的滴度越高，其中的干扰物质的影响就越小。n滴度的测定：以一定浓度的*Ag与稀释度不同的抗体进行反应，当*Ag的结合率为50%时对
5、应的抗体的稀释度即为该抗体的滴度。这时的抗体浓度就是实际使用时的浓度。18（三）数据处理n1、logit-log模型n2、四参数logistic模型：n3、四参数质量作用定律模型19三、质量控制 Quality Control,QCn（一）定义：质量控制 就是控制误差，即对分析工作中的误差进行经常性的检查，遇有质量异常则及时采取对策，以保证分析误差控制在可接受的范围内。n放射免疫分析是一类高灵敏度的超微量分析技术，极易受各种因素的影响而使检测结果失真，因此必须有严格的质量控制体系。20（二）误差的来源n1、系统误差：这种误差表现为检测结果呈倾向性的偏高或偏低，常有一些可以确定的因素导致，如：量
6、器不准、试剂不纯、标准品的定量不准、仪器状态不佳、分离效果不好、不适当的曲线拟合模型等等，系统误差是通过努力可以消除的。n2、随机误差：这种误差多由难以确定且无法控制的原因引起，误差的出现是随机的，由各种偶然因素造成，符合正态分布，如量取液体或分离时的误差。21（三）实验室内部质量控制n实验室内部质量控制侧重对检测质量的控制，它保证从收集样本开始到发出报告为止的全过程中，能及时发现检测过程中出现的各种误差，分析产生的原因，找出纠正的办法，以确保检测的质量。n常用以下指标对检测结果做可靠性评价：精密度、准确度、特异性、灵敏度、稳定性、有效性22n1、精密度（precision）是指在相同条件下对
7、某一样品多次检测所得结果的符合程度，即复管的重复性，它是最重要的质量参数。常用精密度图来评价实验室内部的精密度水平。n2、准确度（accuracy）是指测定值与真值的接近程度，用回收率来评价，回收率是反应测定值偏差的质控指标。n3、灵敏度（sensitivity）是指检测能与零剂量区分的最小检测量。累计10次测定结果，计算出零标准管的结合率为X2SD时对应的剂量值，即为灵敏度。24第二节 免疫放射分析 immunoradiometric assay,IRMAn免疫放射分析技术是1968年由Miles和Hales创立的，IRMA是非竞争性体外放射分析技术的代表。25一、基本原理n用放射性核素标记
8、抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的标记抗体，抗原与标记抗体进行全量反应，多余的抗体用一定的手段除去，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原量正相关。26RIA和IRMA低剂量区的不确定因素示意图28IRMA的特点n1、属于非竞争性抗原抗体结合反应；n2、抗原抗体复合物的与抗原的量正相关n3、在低剂量区不会有不确定因素n4、IRMA的非特异性结合对低剂量区的影响大29二、基本方法n1、双抗体夹心法n2、标记第三抗体法n3、生物素-亲和素系统的应用3132RIA和IRMA的区别项目 RIA IRMA反应机制竞争性反应非竞争性反应反应试剂抗原、标记抗原、抗体抗原、过量的标记抗体分离方法只需一个抗原决定族需两个或两个以上抗原决定族复合物的放射性与待测抗原量呈负相关与待测抗原量呈正相关NSB的影响主要影响高剂量区主要影响低剂量区