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1、第五章体外分析技术第五章体外分析技术本讲稿第一页，共六十二页2定义以放射性核素或其他非放射性物质标记的以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。量生物活性物质的检测技术。本讲稿第二页，共六十二页3 待测物质浓度与检测手段待测物质浓度与检测手段 临床化学分析临床化学分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLm mg/mLmg/mLg/L免疫分析免疫分析Therapeutic DrugsThyroid Hormone
2、Fertility HormoneAllergyCancer MarkersInfectious DiseaseVitaminsSerum Proteins常量常量微量微量超微量超微量本讲稿第三页，共六十二页4 体外分析技术是结合了放射性核素的高灵体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便度好、应用面广、方法简便等优点。等优点。本讲稿第四页，共六十二页方法学基础方法学基础结合反应结合反应n n遵守可逆反应的质量作用定律
3、：遵守可逆反应的质量作用定律：k1,v1R+L RL k2,v2本讲稿第五页，共六十二页定量手段定量手段n n放射性测量技术放射性测量技术n n酶定量技术酶定量技术n n化学发光定量技术化学发光定量技术本讲稿第六页，共六十二页生物学基础生物学基础n n特异性结合反应：特异性结合反应：特异性结合反应：特异性结合反应：抗原抗原抗原抗原-抗体的免疫结合反应；抗体的免疫结合反应；抗体的免疫结合反应；抗体的免疫结合反应；配基配基配基配基-受体的结合反应；受体的结合反应；受体的结合反应；受体的结合反应；底物底物底物底物-催化酶之间的酶促反应；催化酶之间的酶促反应；催化酶之间的酶促反应；催化酶之间的酶促反应
4、；n n结合体对：结合体对：结合体对：结合体对：抗原抗原抗原抗原-抗体抗体抗体抗体激素激素激素激素-激素结合球蛋白激素结合球蛋白激素结合球蛋白激素结合球蛋白受体受体受体受体-配体配体配体配体本讲稿第七页，共六十二页8体外分析技术体外放射分析体外放射分析体外非放射分析体外非放射分析放射性竞争放射性竞争结合分析结合分析放射性非竞放射性非竞争结合分析争结合分析放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析 (radioimmunoassay,RIA)RIA)免疫放射分析免疫放射分析免疫放射分析免疫放射分析酶免疫分析酶免疫分析酶免疫分析酶免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析化学发
5、光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析(immunoradiometric assay,IRMA)IRMA)(EIA)(EIA)(CLIA)(CLIA)(FIA)(FIA)分类:本讲稿第八页，共六十二页第第 一一 节节放射免疫分析法放射免疫分析法(Radioimmunoassay)Dr.Yalow 在体外条件下在体外条件下,利用利用Ag与定量的与定量的*Ag对限量的特异性对限量的特异性Ab的竞争结的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量的一种超微量分量的一种超微量分析技术。析技术。本讲稿第九页，共六十二页10基本原理
6、Ag-Ab +Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab +*Ag(B)(F)4*Ag与与Ag 免疫活性相同免疫活性相同4*AgAg AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg *Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag 90%2）半衰期足够长）半衰期足够长3）保持原有抗原的特性）保持原有抗原的特性大分子：大分子：125I小分子：小分子：3H or 125I本讲稿第二十四页，共六十二页3.非标记抗原非标记抗原 （标准品）（标准品）化学结构、免疫活性与被测抗原相同化学结构、免疫活性与被测抗原相同高纯度高纯度本讲稿第二十五页，共六十二页二、基本方法二、基本方法 B和和F的分离的分离1、第一类、第一类2、第
7、二类、第二类双抗体沉淀法双抗体沉淀法PEG沉淀法沉淀法固相第二抗体法固相第二抗体法+AgAb(1)Ab(2)Ab(2)Ab(1)Ag可溶性复合物可溶性复合物可沉淀复合物可沉淀复合物试管试管试管试管本讲稿第二十六页，共六十二页分离方法的要求分离方法的要求n n分离完全、快速。分离完全、快速。分离完全、快速。分离完全、快速。n n不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原原原原-抗体复合物解离或形成新的复合物。抗体复合物解离或形成新的复合物。抗体复
8、合物解离或形成新的复合物。抗体复合物解离或形成新的复合物。n n受环境因素（温度、受环境因素（温度、受环境因素（温度、受环境因素（温度、PHPHPHPH值等）的影响小。值等）的影响小。值等）的影响小。值等）的影响小。n n操作简便，分离剂来源丰富、价廉。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。本讲稿第二十七页，共六十二页三、质量控制三、质量控制（quality controlquality control）1 1、精密度（、精密度（、精密度（、精密度（precisionprecision）变异系数（变异系数（变异系数（变异系数（CV CV
9、）7%10%7%10%2、准确度（、准确度（accuracy）回收率回收率=测定值测定值/真实值真实值100%90%110%3、灵敏度、灵敏度（sensitivity）方法的最小可测量方法的最小可测量4、特异性（、特异性（specificity）交叉反应率交叉反应率5、可靠性（、可靠性（validity）平行性试验平行性试验6、稳定性（、稳定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75 ABC本讲稿第二十八页，共六十二页 质量控制就是使用合适的方法以检查、表示质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这和消除来自试剂药盒和测量体系的误
10、差，并使这种误差降低到某一允许水平。种误差降低到某一允许水平。具体作用有：具体作用有：1 1 1 1检查误差的程度，决定测定结果的取舍。检查误差的程度，决定测定结果的取舍。检查误差的程度，决定测定结果的取舍。检查误差的程度，决定测定结果的取舍。2 2 2 2识别误差的来源并消除其原因。识别误差的来源并消除其原因。识别误差的来源并消除其原因。识别误差的来源并消除其原因。3 3 3 3改进测定方法的设计以提高质量。改进测定方法的设计以提高质量。改进测定方法的设计以提高质量。改进测定方法的设计以提高质量。本讲稿第二十九页，共六十二页RIA RIA 小小 结结1.1.灵敏度高灵敏度高2.2.特异性好特
11、异性好3.3.精确的定量精确的定量4.4.方法操作简便方法操作简便本讲稿第三十页，共六十二页第二节第二节 免疫放射分析法免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab +*Ab（immunoradiometric assay,IRMA）B%Ag（B）（F）在体外在体外,利用利用AgAg与过量的与过量的*AbAb的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出量来计算出Ag Ag 量。标记抗体，抗体是过量的。量。标记抗体，抗体是过量的。本讲稿第三十一页，共六十二页IRMA与与RIA工作原理的主要区别工作原理的主要区别RIAIRMA竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗
12、原抗体结合反应采用标记抗原采用标记抗体三种主要反应试剂二种主要反应试剂所用抗体是限量的所用抗体是过量的*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关反应到达平衡慢反应到达平衡快非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响低剂量区低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素本讲稿第三十二页，共六十二页B%B%拟合的标准曲线拟合的标准曲线拟合的拟合的NSB拟合的标准曲线拟合的标准曲线拟合的拟合的NSBIRMA的标准曲线及非特的标准曲线及非特异结合曲线异结合曲线RIA的标准曲线及的标准曲线及非特异结合曲线非特异结合曲线本讲稿第三十三页，共六十二页IRMAIRMA和和和和RIAR
13、IA低剂量区的不确定因素示意图低剂量区的不确定因素示意图低剂量区的不确定因素示意图低剂量区的不确定因素示意图RIA+或或01IRMA+1本讲稿第三十四页，共六十二页非放射性标记免疫分析技术非放射性标记免疫分析技术酶标记免疫分析技术化学发光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术本讲稿第三十五页，共六十二页一、酶标记免疫分析技术一、酶标记免疫分析技术一、酶标记免疫分析技术一、酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技
14、术。其中应用最多的就是酶联性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（免疫吸附分析法（免疫吸附分析法（免疫吸附分析法（ELISAELISAELISAELISA）。）。）。）。是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。的检测技术。的检测技术。的检测技术。本讲稿第三十六页，共六十二页本讲稿第三十七页，共六十二页 ELISA ELISA
15、 ELISA ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与方法是用酶分子标记抗体，进行与方法是用酶分子标记抗体，进行与方法是用酶分子标记抗体，进行与IRMAIRMAIRMAIRMA相似的夹相似的夹相似的夹相似的夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，结合部分上的酶分子的催化活性
16、将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成正比。复合物的量成正比。复合物的量成正比。复合物的量成正比。常用的酶是常用的酶是常用的酶是常用的酶是辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶，底物是，底物是，底物是，底物是四甲基联苯胺四甲基联苯胺四甲基联苯胺四甲基联苯胺 (TMB)(TMB)(TMB)(TMB)，反应后显黄色。，反应后显黄色。，反应后显黄色。，反应后显黄色。本讲稿第三十八
17、页，共六十二页二、化学发光免疫分析技术二、化学发光免疫分析技术n n化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。射性核素作为示踪物的超微量分析技术。n n化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。质。本讲稿第三十九页，共六十二页 1.1.化学发光免疫分析化学发光免疫分析 是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质抗体
18、，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。的数量就可以反映复合物的量。常用的化学发光物质是常用的化学发光物质是异鲁米那异鲁米那和和吖啶酯吖啶酯。本讲稿第四十页，共六十二页 2.2.化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析 和和ELISAELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物殊的底物-金刚烷金刚烷，使底物发射出光子。，使底物发射出光子。此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。
19、此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。本讲稿第四十一页，共六十二页3.3.电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(略略)4.4.生物发光免疫分析生物发光免疫分析(略略)本讲稿第四十二页，共六十二页三、时间分辨荧光免疫分析技术三、时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassaytime-resolved fluoroimmunoassay）时间分辨荧光免疫分析采用时间分辨荧光免疫分析采用时间分辨荧光免疫分析采用时间分辨荧光免疫分析采用稀土元素稀土元素稀土元素稀土元素标记抗体，利用标记抗体，利用标记抗体，利用标记抗体，利用时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获
20、得时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得稀土元素稀土元素稀土元素稀土元素的特的特的特的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。本讲稿第四十三页，共六十二页标记物为具有独特荧光特性的标记物为具有独特荧光特性的稀土金属稀土金属镧系元素镧系元素 镧系元素共有镧系元素共有镧系元素共有镧系元素共有1515种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种种，应用在时间
21、分辨荧光免疫技术种有四种种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种:钐钐钐钐（SmSm），铕（），铕（），铕（），铕（EuEu），镝（），镝（），镝（），镝（DyDy），鋱（），鋱（），鋱（），鋱（TeTe）镧系元素荧光重要特点：镧系元素荧光重要特点：镧系元素荧光重要特点：镧系元素荧光重要特点：1.1.极长的荧光衰退时间极长的荧光衰退时间极长的荧光衰退时间极长的荧光衰退时间 铕：铕：铕：铕：730000ns730000ns，钐：，钐：，钐：，钐：50000ns50000ns，一般荧光物质：，一般荧光物质：，一般荧光物质：，一般荧光物质：10ns10ns 2.200nm 2.200nm的的的的Sto
22、kesStokes位移位移位移位移 铕：激发光铕：激发光铕：激发光铕：激发光340nm340nm，发射光，发射光，发射光，发射光613nm613nm 荧光素的荧光素的荧光素的荧光素的StokesStokes位移为位移为位移为位移为273nm273nm 3.3.狭窄的发射峰狭窄的发射峰狭窄的发射峰狭窄的发射峰 4.4.解离解离解离解离-增强技术可使其荧光性提高增强技术可使其荧光性提高增强技术可使其荧光性提高增强技术可使其荧光性提高100100万倍万倍万倍万倍本讲稿第四十四页，共六十二页时间分辨荧光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay
23、）一、基本原理一、基本原理镧系元素（镧系元素（1515）：铕（）：铕（EuEu），钐（），钐（SmSm），镝（），镝（DyDy），鋱（），鋱（TeTe）Eu+EuEu+增强液增强液+Eu“解离增强镧系荧光免疫分析解离增强镧系荧光免疫分析”本讲稿第四十五页，共六十二页时间分辨荧光检测的基本原理示意图时间分辨荧光检测的基本原理示意图荧光衰退时间荧光衰退时间铕：铕：730000 ns钐：钐：50000 ns一般荧光物质：一般荧光物质：10 ns铕的荧光铕的荧光本讲稿第四十六页，共六十二页二、二、TrFIATrFIA的特点的特点1.最大限度提高测量方法的灵敏度最大限度提高测量方法的灵敏度2.有与有与R
24、IA相似的特异性和精密度相似的特异性和精密度3.可同时测定两种以上的抗原可同时测定两种以上的抗原4.无辐射污染无辐射污染本讲稿第四十七页，共六十二页DELFIA技术的特点为临床检测带来的先进性技术的特点为临床检测带来的先进性技技术术特点特点检验检验先先进进性性时间时间分辨分辨波波长长分辨分辨将特异性将特异性荧荧光与非特异性光与非特异性荧荧光光分离开分离开零背景零背景高特异性高特异性解离解离-增增强强荧荧光性大大提高光性大大提高稳稳定的定的荧荧光螯合物光螯合物线线性范性范围围更更宽宽重复性更好重复性更好低分子量原子低分子量原子标记标记标记标记位点多可达位点多可达20个个对标记对标记物的物的结结构
25、与活性影响小构与活性影响小无衰无衰变变受受环环境影响小境影响小灵敏度更高灵敏度更高高高稳稳定性，高精确度定性，高精确度试剂试剂保保质质期至少一年期至少一年标标准曲准曲线线保留保留时间长时间长同一批次只需两点定同一批次只需两点定标标多多标记标记单单，双，三，四，双，三，四标记标记一个一个试剂试剂盒可同盒可同时测时测多个多个项项目目本讲稿第四十八页，共六十二页总结总结：体外分析的发展体外分析的发展n n方法设计的改变：竞争结合分析方法设计的改变：竞争结合分析 非竞争结非竞争结合分析，代表方法是免疫放射分析合分析，代表方法是免疫放射分析n n标记物的改变：放射性核素标记物的改变：放射性核素 荧光、酶
26、、化学发荧光、酶、化学发光、稀土元素光、稀土元素n n结合体的改变结合体的改变 本讲稿第四十九页，共六十二页 微生物微生物微生物微生物 RMA RMA RMA RMA 酶酶酶酶 REA REA REA REA 受体受体受体受体 RRA RRA RRA RRA 特异结合蛋白特异结合蛋白特异结合蛋白特异结合蛋白 CPBA CPBA CPBA CPBA 改变结合体对改变结合体对改变结合体对改变结合体对放射性技术放射性技术放射性技术放射性技术 Ag Ag-Ab Ag Ag-Ab Ag Ag-Ab Ag Ag-Ab RIA +Ab RIA +Ab RIA +Ab RIA +Ab免疫学技术免疫学技术免疫学
27、技术免疫学技术 AgAgAgAg Ag-AbAg-AbAg-AbAg-Ab 改变标记物改变标记物改变标记物改变标记物第一阶段第一阶段第一阶段第一阶段 第二阶段第二阶段第二阶段第二阶段 第三阶段第三阶段第三阶段第三阶段小分子半抗原联接小分子半抗原联接125125I I单克隆技术单克隆技术固相技术固相技术药品化药品化KitKit理论与实践上更丰富更完善的理论与实践上更丰富更完善的RIARIA1 1.可测物达可测物达300300多种多种2.2.涉及多个临床与基础学科涉及多个临床与基础学科 3 3.RIARIA显像显像 4 4.RIARIA治疗治疗 荧光荧光 FIA IRMA化学发光化学发光 CIA 酶酶 EIA本讲稿第五十页，共六十二页本讲稿第五十一页，共六十二页本讲稿第五十二页，共六十二页本讲稿第五十三页，共六十二页本讲稿第五十四页，共六十二页本讲稿第五十五页，共六十二页本讲稿第五十六页，共六十二页本讲稿第五十七页，共六十二页本讲稿第五十八页，共六十二页本讲稿第五十九页，共六十二页本讲稿第六十页，共六十二页本讲稿第六十一页，共六十二页本讲稿第六十二页，共六十二页