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1、 实验四实验四 细菌革兰氏染色细菌革兰氏染色目的：1、了解细菌革兰氏染色的原理 2、学习及掌握革兰氏染色方法内容：1、涂片 2、革兰氏染色 细菌染色的目的意义：细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。清楚，如将其染色，使折光率增大，
2、便容易观察。清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌及其结构。细菌及其结构。细菌及其结构。细菌及其结构。染色的基本原理染色的基本原理1、用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性、用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电
3、染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。荷，能和带负电荷的物质结合。2、革兰氏染色法所以能将细菌分为、革兰氏染色法所以能将细菌分为G+菌和菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。决定的。染色剂（染料）：染色剂（染料）：是苯环上含有是苯环上含有发色基团发色基团和和助色基团助色基团的化的化合物。发色基团使化合物本身具有染色之合物。发色基团使化合物本身具有染色之能力，助色基团有电离特性，可以于被染能力，助色基团有电离特性，可以于被染物结合，使被染物着色。物结合，使被染物着色。染色剂分类：染色剂分类：碱性染色剂：（
4、电离后分子带正电荷）；碱性染色剂主要用于碱性染色剂：（电离后分子带正电荷）；碱性染色剂主要用于碱性染色剂：（电离后分子带正电荷）；碱性染色剂主要用于碱性染色剂：（电离后分子带正电荷）；碱性染色剂主要用于 染核和异染颗粒等细胞结构。染核和异染颗粒等细胞结构。染核和异染颗粒等细胞结构。染核和异染颗粒等细胞结构。酸性染色剂：（电离后分子带负电荷）；酸性染色剂主要用于酸性染色剂：（电离后分子带负电荷）；酸性染色剂主要用于酸性染色剂：（电离后分子带负电荷）；酸性染色剂主要用于酸性染色剂：（电离后分子带负电荷）；酸性染色剂主要用于 染细胞质。染细胞质。染细胞质。染细胞质。复合染色剂：（在电离后分子不带电荷
5、，故也称为中性染色复合染色剂：（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色复合染色剂：（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色复合染色剂：（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色 剂）；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次剂）；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次剂）；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次剂）；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次 氏体。氏体。氏体。氏体。涂片染色程序：涂片 自然干燥 固定 染色干燥 镜检大肠杆菌、枯草杆菌大肠杆菌、枯草杆菌 水水革兰氏染色革兰氏染色可将所有的细菌分为两大类，蓝色的革兰氏阳性菌和红色的革兰氏阴性菌。是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。革兰氏染色步骤为：紫、碘
6、、酒、红四步。1、草酸铵结晶紫染色1-2 min（碱性染料着染）水洗；2、革兰氏碘液染1-3 min（媒染剂媒染）水 洗；3、酒精脱色30s-1 min（脱色剂）水洗；4、稀释的石炭酸复红10-30s（复染）水洗。干燥镜检。革兰氏染色时注意事项：革兰氏染色时注意事项：1、要用幼龄培养物作革兰氏染色；、要用幼龄培养物作革兰氏染色；2、涂片不宜太厚，以免脱色不完全造成假阳、涂片不宜太厚，以免脱色不完全造成假阳性性革兰氏染色原理：细菌细胞壁的化学组成和结构不同。革兰氏阳性菌：革兰氏阳性菌：细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的
7、大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。革兰氏阴性菌：革兰氏阴性菌：细胞壁肽聚糖层薄，网状结构交联少，类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细菌细胞被脱色，再经石炭酸复红复染后细胞呈红色。革兰氏染色步骤革兰氏染色步骤涂片涂片草草酸酸铵铵结结晶晶紫紫 碘碘 液液95%酒精酒精 稀稀释释的的石石 炭炭酸酸复复红红自然干燥自然干燥媒染媒染2-3min脱色脱色2030s固定固定初染初染1min复染复染1030s干燥干燥镜检镜检接接种种环环蒸蒸馏馏水水思考题：1 1、革兰氏染色的关键步骤是什么？、革兰氏染色的关键步骤是什么？2 2、当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作、当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？正确，结果可靠？3 3、进行革兰氏染色时注意那些事项？、进行革兰氏染色时注意那些事项？作业：作业：原理、方法、结果、分析讨论及绘图原理、方法、结果、分析讨论及绘图 绘图：绘图：绘出用革兰氏染色法染出的细菌形态图绘出用革兰氏染色法染出的细菌形态图要求：要求：视野要圆；细菌的大小要合理；并写出菌名视野要圆；细菌的大小要合理；并写出菌名及放大倍数；用铅笔。标出染的细菌种类及颜色。及放大倍数；用铅笔。标出染的细菌种类及颜色。