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1、实验三 细菌的革兰氏染色第1页，本讲稿共12页一一、实验目的与要求、实验目的与要求:1、了解革兰氏染色法的原理及其、了解革兰氏染色法的原理及其 在细菌分类鉴定中的重要性在细菌分类鉴定中的重要性2、学习并掌握革兰氏染色法、学习并掌握革兰氏染色法 第2页，本讲稿共12页二、实验原理：二、实验原理：革兰氏染色法是革兰氏染色法是18841884年由丹麦病理学家年由丹麦病理学家C.GramC.Gram所所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（阳性菌（G G+）和革兰氏阴性菌（）和革兰氏阴性菌（G G）两大类，是细）两大类，是细菌学上最常用的鉴
2、别染色法。该染色法所以能将细菌菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为分为G G+菌和菌和G G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。不同所决定的。第3页，本讲稿共12页G-G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色
3、。脱色，再经番红复染后就成红色。G+G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。此细菌仍保留初染时的颜色。第4页，本讲稿共12页三、实验仪器及材料三、实验仪器及材料1.1.仪器：显微镜、酒精灯等仪器：显微镜、酒精灯等 2.2.实验材料：实验材料：菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌 染色剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、染色剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、番红、番红、95%95%乙醇乙醇 第5页，本讲
4、稿共12页四、内容与方法四、内容与方法 1.1.涂片涂片 2.2.晾干晾干 3.3.固定固定 4.4.结晶紫染色：加适量（以盖结晶紫染色：加适量（以盖 满细菌涂面）的结晶紫染色满细菌涂面）的结晶紫染色 液染色液染色1 1分钟；分钟；5.5.水洗：倾去染色液，用水小水洗：倾去染色液，用水小 心地冲洗。心地冲洗。第6页，本讲稿共12页6.6.媒染：碘液，媒染媒染：碘液，媒染1min1min；7.7.水洗：用水洗去碘液。水洗：用水洗去碘液。8.8.脱色：将玻片倾斜，连续滴加脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%95%乙醇脱乙醇脱 色色10s-18s10s-18s至流出液无色，立即水洗。至流出液无色，立即水
5、洗。9.9.复染：滴加番红复染复染：滴加番红复染1min1min；10.10.水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。11.11.晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。12.12.镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最 后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染 色反应性。色反应性。第7页，本讲稿共12页第8页，本讲稿共12页革兰氏染色流程图革兰氏染色流程图涂片涂片涂片涂片 干燥干燥干燥干燥 结晶紫染色结晶紫染色结晶紫染色结晶紫染色碘液媒染碘液媒染碘液媒染碘液媒染 水洗水洗水洗水洗 9
6、5%95%95%95%酒精脱色酒精脱色 水洗水洗水洗水洗 番红染色番红染色番红染色番红染色 水洗水洗水洗水洗 晾干晾干晾干晾干 镜检镜检镜检镜检1 1分钟分钟1010秒秒1 1分钟分钟固定固定固定固定水洗水洗水洗水洗 1 1分钟分钟第9页，本讲稿共12页 注意事项：注意事项：1.1.1.1.革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是酒精脱色酒精脱色酒精脱色酒精脱色。如脱色。如脱色。如脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性
7、菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被 染成革兰氏阳性菌。染成革兰氏阳性菌。染成革兰氏阳性菌。染成革兰氏阳性菌。2.2.2.2.菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡 或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.3.3.3.不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。不要涂片
8、太厚，会造成假阴性或假阳性。不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。第10页，本讲稿共12页五、实验结果：五、实验结果：紫色菌：紫色菌：革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 红色菌：色菌：革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌第11页，本讲稿共12页六、思考题六、思考题1.1.1.1.你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？其中最关键的环节是什么？其中最关键的环节是什么？其中最关键的环节是什么？2.2.2.2.现有一株细菌宽度明显
9、大于大肠杆菌的粗壮杆菌，现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应，请你鉴定其革兰氏染色反应，请你鉴定其革兰氏染色反应，请你鉴定其革兰氏染色反应，你怎么运用大肠杆菌你怎么运用大肠杆菌你怎么运用大肠杆菌你怎么运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确。明你的染色结果正确。明你的染色结果正确。明你的染色结果正确。第12页，本讲稿共12页