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1、实验二实验二细菌革兰氏染色细菌革兰氏染色一、实验目的一、实验目的n n学习微生物制片、染色的基本技术学习微生物制片、染色的基本技术学习微生物制片、染色的基本技术学习微生物制片、染色的基本技术n n掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术n n进一步观察细菌的基本形态进一步观察细菌的基本形态进一步观察细菌的基本形态进一步观察细菌的基本形态（革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。二、实验原理二、实验原理 革兰氏染色革兰氏染色1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染
2、初染2、用碘溶液进行、用碘溶液进行媒染媒染，其作用是提高染料和细，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。3、用乙醇或丙酮冲洗进行、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色脱色。在经历脱色后。在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。胞呈无色。4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行涂片进行复染复染。例如沙黄，它使原来无色的。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌
3、最后呈现桃红到红色，而革革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色兰氏阳性细菌继续保持深紫色三、实验材料三、实验材料1、菌种：大肠杆菌（）、枯草杆菌（）、菌种：大肠杆菌（）、枯草杆菌（）2、染料：结晶紫、复红、碘液等、染料：结晶紫、复红、碘液等3、材料：、材料：95%酒精等酒精等n n涂片涂片涂片涂片风干风干风干风干固定固定固定固定初染初染初染初染水洗水洗水洗水洗媒染媒染媒染媒染水洗水洗水洗水洗脱色脱色脱色脱色水洗水洗水洗水洗复染复染复染复染水洗水洗水洗水洗干燥干燥干燥干燥镜检镜检镜检镜检四、实验方法四、实验方法菌悬液菌悬液菌悬液菌悬液涂片涂片涂片涂片干燥干燥干燥干燥滴
4、加无滴加无滴加无滴加无菌水菌水菌水菌水固定固定固定固定取菌苔取菌苔取菌苔取菌苔涂片涂片涂片涂片Smear preparation Heat fixingcrystal violet stain wash with water Staining Counterstain with Safranin 注意事项：注意事项：（1 1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜
5、。固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。（2 2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色 时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革 兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌
6、。（3 3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。（4 4）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。五、思考题五、思考题1、讲述革兰氏染色的原理并指出和分别属于革兰氏阳性、讲述革兰氏染色的原理并指出和分别属于革兰氏阳性或阴性？或阴性？2、观察细菌为什么要染色？为什么细菌染色多采用碱性、观察细菌为什么要染色？为什么细菌染色多采用碱性染料？染料？3、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？革兰氏染色、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？革兰氏染色成败的关键一步是什么？成败的关键一步是什么？4、当对未知菌进行革兰氏染色时，怎样能证明你的染色、当对未知菌进行革兰氏染色时，怎样能证明你的染色技术和结果的正确性？技术和结果的正确性？