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1、实验五 细菌的革兰氏染色第1页，本讲稿共14页一一、实验目的、实验目的了解革兰氏染色法的原理，学习了解革兰氏染色法的原理，学习并掌握革兰氏染色方法并掌握革兰氏染色方法。第2页，本讲稿共14页二、实验原理：二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利小而透明，在普通的光学显微
2、镜下不易识别，必须对它们进行染色。利小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。从而能更清楚地观察到其形态和结构。从而能更清楚地观察到其形态和结构。从而能更清楚地观察到其形态和结构。常用碱性染料进行简单染色，这是因为细菌的等电点较低，常用碱性染料进行简单染色，这是因为细菌的等电点较低，常用碱
3、性染料进行简单染色，这是因为细菌的等电点较低，常用碱性染料进行简单染色，这是因为细菌的等电点较低，约在约在约在约在pH 2pH 2pH 2pH 25 5 5 5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白菌体蛋白菌体蛋白菌体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如结晶紫、碱性质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如结晶紫、碱性质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如结晶紫、碱性质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）等结合，复红、沙黄（番红）等结
4、合，复红、沙黄（番红）等结合，复红、沙黄（番红）等结合，使细菌被染成紫色或红色。使细菌被染成紫色或红色。使细菌被染成紫色或红色。使细菌被染成紫色或红色。第3页，本讲稿共14页 革兰氏染色法是革兰氏染色法是18841884年由丹麦病理学家年由丹麦病理学家C.GramC.Gram所所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（阳性菌（G G+）和革兰氏阴性菌（）和革兰氏阴性菌（G G）两大类，是细菌）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G G+菌和菌和G G菌，是由这两
5、类菌的细胞壁结构和成分的不菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。同所决定的。第4页，本讲稿共14页G-G-菌菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫-碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成色，再经番红复染后就成红色红色。G+G+菌菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱
6、色剂处理后反而使类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，保保留结晶紫留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，碘复合物在细胞膜上，因此细因此细菌仍保留初染时的颜色菌仍保留初染时的颜色紫色紫色。第5页，本讲稿共14页三、实验仪器及材料三、实验仪器及材料1.1.仪器：显微镜、酒精灯等仪器：显微镜、酒精灯等 2.2.实验材料：实验材料：菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 染色剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、染色剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、番红、番红、95%95%乙醇乙醇 第6页，本讲稿共14页四、实验内容与步骤四、实验内容与步骤革兰
7、氏染色流程图革兰氏染色流程图涂片涂片涂片涂片 干燥干燥干燥干燥 结晶紫染色结晶紫染色结晶紫染色结晶紫染色碘液媒染碘液媒染碘液媒染碘液媒染 水洗水洗水洗水洗 95%95%95%95%酒精脱色酒精脱色酒精脱色酒精脱色 水洗水洗水洗水洗 番红染色番红染色番红染色番红染色 水洗水洗水洗水洗 晾干晾干晾干晾干 镜检镜检镜检镜检固定固定固定固定水洗水洗水洗水洗 第7页，本讲稿共14页1 1 1 1涂片涂片涂片涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一
8、滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大涂布面不宜过大涂布面不宜过大涂布面不宜过大。2 2 2 2干燥干燥干燥干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可涂片最好在室温下
9、使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但加热，使水分蒸发，但加热，使水分蒸发，但加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤切勿紧靠火焰或
10、加热时间过长，以防标本烤枯而变形。枯而变形。枯而变形。枯而变形。第8页，本讲稿共14页3 3 3 3固定固定固定固定 固固固固定定定定常常常常常常常常利利利利用用用用高高高高温温温温，手手手手持持持持载载载载玻玻玻玻片片片片的的的的一一一一端端端端，标标标标本本本本向向向向上上上上，在在在在酒酒酒酒精精精精灯灯灯灯火火火火焰焰焰焰外外外外层层层层尽尽尽尽快快快快的的的的来来来来回回回回通通通通过过过过2323次次次次，共共共共约约约约2323秒秒秒秒钟钟钟钟，并并并并不不不不时时时时以以以以载载载载玻玻玻玻片片片片背背背背面面面面加加加加热热热热触触触触及及及及皮皮皮皮肤肤肤肤，不不不不觉觉觉
11、觉过过过过烫烫烫烫为为为为宜宜宜宜（不不不不超超超超过过过过6060）,放放放放置置置置待待待待冷冷冷冷后后后后，进进进进行行行行染色。染色。染色。染色。4 4 4 4初染初染初染初染 用用用用草酸铵结晶紫草酸铵结晶紫草酸铵结晶紫草酸铵结晶紫染色染色染色染色1-2min1-2min1-2min1-2min后倾去染液，水洗至流出水无色。后倾去染液，水洗至流出水无色。后倾去染液，水洗至流出水无色。后倾去染液，水洗至流出水无色。5 5 5 5、媒染、媒染、媒染、媒染 先用碘液冲去残留水迹，再加先用碘液冲去残留水迹，再加先用碘液冲去残留水迹，再加先用碘液冲去残留水迹，再加碘液覆盖碘液覆盖碘液覆盖碘液覆
12、盖媒染媒染媒染媒染1min1min1min1min后水洗。后水洗。后水洗。后水洗。6 6 6 6脱色脱色脱色脱色 斜斜斜斜置置置置载载载载玻玻玻玻片片片片，滴滴滴滴加加加加9595乙乙乙乙醇醇醇醇脱脱脱脱色色色色，至至至至流流流流出出出出的的的的乙乙乙乙醇醇醇醇不不不不现现现现紫紫紫紫色色色色为为为为止止止止，大大大大约约约约需时需时需时需时2030s2030s，随即水洗，随即水洗，随即水洗，随即水洗。第9页，本讲稿共14页7 7 7 7复染复染复染复染 将将将将玻玻玻玻片片片片上上上上残残残残留留留留水水水水用用用用吸吸吸吸水水水水纸纸纸纸吸吸吸吸去去去去，用用用用番番番番红红红红染染染染液
13、液液液复复复复染染染染1min1min，水水水水洗，吸去残水晾干。洗，吸去残水晾干。洗，吸去残水晾干。洗，吸去残水晾干。8 8 8 8、镜检、镜检、镜检、镜检 待标本片置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用待标本片置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用待标本片置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用待标本片置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果革兰氏染色的结果革兰氏染
14、色的结果革兰氏染色的结果。9.9.9.9.混合涂片染色混合涂片染色混合涂片染色混合涂片染色第10页，本讲稿共14页 注意事项：注意事项：1.1.1.1.革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是酒精脱色酒精脱色酒精脱色酒精脱色。如脱色。如脱色。如脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性 菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被菌；如脱色时间过短，革兰氏
15、阴性菌也会被 染成革兰氏阳性菌。染成革兰氏阳性菌。染成革兰氏阳性菌。染成革兰氏阳性菌。2.2.2.2.菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡 或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.3.3.3.不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。第11页，本讲稿共14页五、实验结果：五、实验结果：紫色菌：紫色菌：革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 红红色菌：色菌：革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌第12页，本讲稿共14页第13页，本讲稿共14页六、思考题六、思考题1、造成革兰氏染色结果不正确（假阴、造成革兰氏染色结果不正确（假阴性或假阳性）的主要原因有哪些？性或假阳性）的主要原因有哪些？2、你认为革兰氏染色法中那个步骤可、你认为革兰氏染色法中那个步骤可以省略？在什么情况下？以省略？在什么情况下？第14页，本讲稿共14页