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1、如何分离鉴定氨基酸混合液？如何分离鉴定氨基酸混合液？生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心氨基酸的薄层层析氨基酸的薄层层析(Thin layer chromatography of amino acids)生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心实验目的实验目的l掌握薄层层析法的一般原理。掌握薄层层析法的一般原理。l掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。l掌握如何根据移动速率（掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。的物质（即氨基酸混合液）。层析技术层析技术l概念：概
2、念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的。l特点：特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质的分离纯分，也可用于大量物质的分离纯化和制备。层析法的分类层析法的分类l气相层析（以气体为流动相的层析法）气相层析（以气体为流动相的层析法）l液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学领域里常用的方法）物化学领域里常用的方法）1.吸附层析：吸附层析：薄层吸附层析、薄层吸附层析、吸附柱层析吸附柱层析 2.分配层
3、析：纸层析、柱层析、分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析薄层层析 3.离子交换层析离子交换层析 4.凝胶层析：柱层析、薄膜层析凝胶层析：柱层析、薄膜层析 5.亲和层析亲和层析 实验原理实验原理 1.1.1.1.薄层层析法是色谱分析技术的一种薄层层析法是色谱分析技术的一种薄层层析法是色谱分析技术的一种薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为为固定相固定相。当。当液相液相（展开溶剂）在固定相上流动时，（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样吸附力不一样，不同氨基，不同氨基酸在展
4、开溶剂中的酸在展开溶剂中的溶解度不一样溶解度不一样，点在薄板上的混合，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同移动速率也不同，因而可以，因而可以彼此分开。（即通过吸附彼此分开。（即通过吸附-解吸解吸-再吸附再吸附-再解吸的反再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）复进行，而将样品各组分分离开来）2.2.2.2.氨基酸与茚三酮的显色反应氨基酸与茚三酮的显色反应氨基酸与茚三酮的显色反应氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成茚三酮水化后生成水化茚三酮水化茚三酮，它与氨，它与氨基酸的羧基反应生成基酸的羧基反应生成还原茚三酮还原茚三酮、氨及醛，、氨及醛，与此同时，
5、还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成生成蓝色化合物蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。而使氨基酸斑点显色。实验原理实验原理实验原理实验原理3.3.3.3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率迁移率迁移率迁移率RRRRf f f f值（值（值（值（rate of flowrate of flowrate of flowrate of flow）来表示。）来表示。）来表示。）来表示。层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离
6、与溶液层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为前沿的距离之比为前沿的距离之比为前沿的距离之比为R R R Rf f f f值。值。值。值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（移动速率（移动速率（移动速率（R R R Rf f f f值）也是恒定的，因此可以值）也是恒定的，因此可以值）也是恒定的，因此可以值）也是恒定的，因此可以根据根据根据根据R R R
7、Rf f f f值来值来值来值来鉴定被分离的物质。鉴定被分离的物质。鉴定被分离的物质。鉴定被分离的物质。实验材料实验材料l吸附剂：吸附剂：硅胶硅胶硅胶硅胶l粘合剂：粘合剂：0.5%0.5%的羧甲基纤维素钠的羧甲基纤维素钠的羧甲基纤维素钠的羧甲基纤维素钠l氨基酸的异丙醇溶液氨基酸的异丙醇溶液 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸丙氨酸、精氨酸、甘氨酸l展开展开-显色剂显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）l分析样品：分析样品：氨基酸混合液氨基酸混合液器材器材l层析板、尺子、铅笔层析板、尺子、铅笔l烧杯、量筒烧杯、量筒l喷雾器、吹风机喷雾器、吹风机l毛细管、层析缸毛细管、层析缸l药匙药匙
8、l烘烤箱烘烤箱操作步骤操作步骤 薄层板的制备薄层板的制备 1 1 1 1、调浆、调浆、调浆、调浆 称取称取称取称取硅胶硅胶硅胶硅胶3 3 3 3克克克克，加，加，加，加0.5%0.5%0.5%0.5%的羧甲基纤维素的羧甲基纤维素的羧甲基纤维素的羧甲基纤维素钠钠钠钠8 8 8 8毫升毫升毫升毫升，调成均匀的糊状。，调成均匀的糊状。，调成均匀的糊状。，调成均匀的糊状。2 2 2 2、涂布、涂布、涂布、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。3 3 3 3、干燥、干燥、干燥、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。将玻璃板
9、水平放置，室温下自然凉干。将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。4 4 4 4、活化、活化、活化、活化 70 70 70 70烘干烘干烘干烘干30303030分钟。分钟。分钟。分钟。切断电源，待玻璃板切断电源，待玻璃板切断电源，待玻璃板切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。面温度下降至不烫手时取出。面温度下降至不烫手时取出。面温度下降至不烫手时取出。操作步骤操作步骤 点样点样2cm1cm1 1 1 1、位置：用铅笔距底边、位置：用铅笔距底边、位置：用铅笔距底边、位置：用铅笔距底边2cm2cm2cm2cm水平线上均匀确定水平线上均匀确定水平线上均匀确定水平线上
10、均匀确定4 4 4 4个个个个点。每个样品间相距点。每个样品间相距点。每个样品间相距点。每个样品间相距1cm1cm1cm1cm。2 2 2 2、用毛细管分别吸取氨、用毛细管分别吸取氨、用毛细管分别吸取氨、用毛细管分别吸取氨基酸溶液，轻轻接触薄层基酸溶液，轻轻接触薄层基酸溶液，轻轻接触薄层基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。表面点样。表面点样。表面点样。3 3 3 3、加样后原点扩散直径、加样后原点扩散直径、加样后原点扩散直径、加样后原点扩散直径不超过不超过不超过不超过2mm2mm2mm2mm。4 4 4 4、待点样点干后再重复、待点样点干后再重复、待点样点干后再重复、待点样点干后再重复点一次。点一
11、次。点一次。点一次。Ala Arg Gly Mix操作步骤操作步骤 展层、显色展层、显色 将薄层板将薄层板将薄层板将薄层板点样端点样端点样端点样端浸入展浸入展浸入展浸入展层层层层-显色剂，展层显色剂，展层显色剂，展层显色剂，展层-显色剂液显色剂液显色剂液显色剂液面应面应面应面应低于低于低于低于点样线。盖好层析点样线。盖好层析点样线。盖好层析点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂缸盖，上行展层。当展层剂缸盖，上行展层。当展层剂缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端前沿离薄板顶端前沿离薄板顶端前沿离薄板顶端2cm2cm2cm2cm时，停时，停时，停时，停止展层，取出薄板，止展层，取出薄板，止展层
12、，取出薄板，止展层，取出薄板，用铅笔用铅笔用铅笔用铅笔描出溶剂前沿界线描出溶剂前沿界线描出溶剂前沿界线描出溶剂前沿界线，用热风，用热风，用热风，用热风吹干或在吹干或在吹干或在吹干或在85858585下烘干，即可下烘干，即可下烘干，即可下烘干，即可显出各层斑点。显出各层斑点。显出各层斑点。显出各层斑点。Ala Arg Gly MixRf=斑点至原点距离斑点至原点距离溶剂前缘至原点距离溶剂前缘至原点距离结果计算结果计算 小心量出斑点中心至原点中心距离，小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的出它们的 值。值。根据根据值，鉴定出
13、混合样品中氨基值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。酸的种类，并绘出层析图谱。注意事项注意事项1.1.1.1.切勿用手直接接触薄层板面。切勿用手直接接触薄层板面。切勿用手直接接触薄层板面。切勿用手直接接触薄层板面。2.2.2.2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。3.3.3.3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。复习思考题复习思考题l硅胶的吸附力与含水量的问题硅胶的吸附力与含水量的问题l吸附实验中吸附剂的选择根据吸附实验中吸附剂的选择根据l氨基酸纸层析，两者有何区别氨基酸纸层析，两者有何区别生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心