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1、生物化学实验7A211 86689978氨氨 基基 酸酸 薄薄 层层 层层 析析Thin Layer Chromatography Of Amino Acid层层 析析层析原理层析原理待分离物质（流动相）经过一个固态物质（固待分离物质（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离物质各组分颗粒定相）时，根据溶液中待分离物质各组分颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离物质中大小、电荷多少及亲和力等，使待分离物质中各组分在两相中反复分配，并以不同速度流经各组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离混合物的目的固定相而达到分离混合物的目的。层析概念层析概念层析为实验室一类分离技
2、术的总称。层析为实验室一类分离技术的总称。层层 析析 分分 类类按流动相按流动相气相层析气相层析液相层析液相层析按固定相形状按固定相形状柱层析柱层析薄层层析薄层层析纸层析纸层析层层 析析 分分 类类类别类别 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝、羟基磷酸、羟基磷酸分配层析分配层析 两溶剂相中的溶解效应两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土纤维素、硅藻土、硅胶、硅胶凝胶过滤凝胶过滤 分子筛效应的排阻效应分子筛效应的排阻效应 琼脂糖、葡聚糖琼脂糖、葡聚糖离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反应离子基团的交换反应 离子交换树
3、脂离子交换树脂 、纤维素、纤维素、葡聚糖葡聚糖亲和层析亲和层析 分离物与配体之间有分离物与配体之间有 带配基的琼脂糖带配基的琼脂糖 特殊亲和力特殊亲和力 或葡聚糖或葡聚糖原原 理理 薄层层析由一平铺固定于玻璃板或塑料板的固定相薄层层析由一平铺固定于玻璃板或塑料板的固定相及一由有机溶剂构成的流动相组成。样品点在固定及一由有机溶剂构成的流动相组成。样品点在固定相，由于样品中不同的成分被固定相吸附剂吸附的相，由于样品中不同的成分被固定相吸附剂吸附的牢固程度不同及在有机溶剂中溶解性质不同，当有牢固程度不同及在有机溶剂中溶解性质不同，当有机溶剂因为毛细管作用沿吸附剂上升时，不同的成机溶剂因为毛细管作用沿
4、吸附剂上升时，不同的成分而被分开。当与一标准物同时层析时，可鉴定未分而被分开。当与一标准物同时层析时，可鉴定未知样品中的不同成分。知样品中的不同成分。操操 作作制板制板点样点样展层展层染色染色 Rf(Retention factor)计算计算1.1.点点 样样2cm铅笔划线铅笔划线(小、均匀小、均匀)2.2.展展 层层:3030 板要端正板要端正划线端朝上划线端朝上/下下?先吹干先吹干 3.3.染染 色色:标记溶剂前沿标记溶剂前沿 吹干吹干 喷茚三酮喷茚三酮 吹干吹干4.4.测量并计算测量并计算Rf=AA斑点中心到底线距离斑点中心到底线距离溶剂前沿到底线距离溶剂前沿到底线距离ArginineL
5、eucineAlanineMixture 前前 沿沿三种氨基酸三种氨基酸Rf的计算的计算实验室规则实验室规则 、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静，不得、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静，不得喧哗吵闹、迟到、早退、缺席。每次实验都要穿白喧哗吵闹、迟到、早退、缺席。每次实验都要穿白大褂、禁止穿拖鞋。大褂、禁止穿拖鞋。、爱护仪器，厉行节约。取用试剂时，应仔、爱护仪器，厉行节约。取用试剂时，应仔细辨明标签，以免取错。取完试剂后，应及时盖好细辨明标签，以免取错。取完试剂后，应及时盖好瓶盖，放回原处，切忌乱拿乱放、瓶盖，放回原处，切忌乱拿乱放、“张冠李戴张冠李戴”。3 3、注意安全、对于有毒、腐蚀的试剂更
6、应注、注意安全、对于有毒、腐蚀的试剂更应注意，应避免其直接接触人体及衣物。意，应避免其直接接触人体及衣物。4 4、注意实验室卫生、整洁。废弃液体应倒入、注意实验室卫生、整洁。废弃液体应倒入水槽，放水冲走。实验用过的和棉花、废纸、沉淀水槽，放水冲走。实验用过的和棉花、废纸、沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器，不得随废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器，不得随意乱扔或丢进水槽。实验结束后应将实验台整理好。意乱扔或丢进水槽。实验结束后应将实验台整理好。并清扫、整理实验室。关好水、电、门、窗。并清扫、整理实验室。关好水、电、门、窗。一、层析技术l1、层析技术概念、层析技术概念l2、层析技术分类、
7、层析技术分类l3、常用层析技术原理、常用层析技术原理色谱起源色谱起源色谱色谱组分组分色素色素石油醚石油醚碳酸钙颗粒碳酸钙颗粒 用色彩（用色彩（chromachroma）和图谱（）和图谱（graphsgraphs）组成色谱一）组成色谱一词（词（Chromatography)Chromatography)，是，是19031903年俄国植物学家年俄国植物学家Michael TswettMichael Tswett发现并命名的发现并命名的l层析：是一种物理的分离方法，利用混合物中各层析：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程组分的物理化学性质的差别，使各组分以不
8、同程度分布在两相中，其中一相为度分布在两相中，其中一相为固定相固定相，另一相流，另一相流过此相称作过此相称作流动相流动相，并使各组分以不同速度移动，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。从而达到分离的目的。1、层析技术概念、层析技术概念2、层析技术分类、层析技术分类名称名称操作方式操作方式固定相固定相流动相流动相分离依据分离依据吸附层析吸附层析吸附薄层层析吸附薄层层析气体吸附层析气体吸附层析固体固体固体固体液体液体气体气体吸附力吸附力分配层析分配层析纸层析纸层析液体液体液体液体溶解度溶解度离子交换层析离子交换层析离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体带电性带电性静电引力静电引力凝
9、胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体分子大小分子大小亲合层析亲合层析酶与底物酶与底物抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体配体专一性配体专一性（1）吸附层析）吸附层析l l原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象
10、。离开，此为吸附现象。离开，此为吸附现象。离开，此为吸附现象。由此产生：由此产生：由此产生：由此产生：吸附吸附吸附吸附 脱离脱离脱离脱离 再吸附再吸附再吸附再吸附 再脱离再脱离再脱离再脱离 的现象的现象的现象的现象l l吸附剂：吸附剂：吸附剂：吸附剂：硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝、活性炭；纤维素、淀粉、聚酰胺；、活性炭；纤维素、淀粉、聚酰胺；、活性炭；纤维素、淀粉、聚酰胺；、活性炭；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。滑石、陶土、粘土。滑石、陶土、粘土。滑石、陶土、粘土。3、常用的层析原理、常用的层析原理（2）分配层析）分配层析纸层析纸层析 原理：溶质在互不相溶的两相中
11、溶解度不同，原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（分配系数（）。）。固定相内溶质的浓度固定相内溶质的浓度固定相内溶质的浓度固定相内溶质的浓度 =流动相内溶质的浓度流动相内溶质的浓度流动相内溶质的浓度流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水固定相：滤纸上吸附的水固定相：滤纸上吸附的水固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（正丁醇）流动相：有机溶剂（正丁醇）流动相：有机溶剂（正丁醇）流动相：有机溶剂（正丁醇）（3）离子交换层析）离子交换层析l l原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于原理
12、：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。惰性基质上，从而分离介质中的组分。惰性基质上，从而分离介质中的组分。惰性基质上，从而分离介质中的组分。l l常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）二乙烯苯）二乙烯苯）二乙烯苯）l l阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阳离子交换剂：磺酸甲
13、基、羧甲基、磷酸基阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基l l阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 l l可交换离子：阳离子：可交换离子：阳离子：可交换离子：阳离子：可交换离子：阳离子：NaNaNaNa+、H H H H+阴离子：阴离子：阴离子：阴离子：ClClClCl-、OHOHOHOH-带带正正电荷多蛋电荷多蛋白紧密结合白紧密结合带带负负电荷多蛋电荷多蛋白流过层析柱白流过层析柱阳阳离离子子交交换换树树脂脂工工作作示示意意图图阳阳离
14、离子子交交换换树树脂脂（4）凝胶过滤）凝胶过滤l l原理：原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。速度不同。速度不同。速度不同。l l物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向垂直向下移动和无定向垂直向下移动和无定向垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒
15、内，只能分的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。内，因此向下移动慢。内，因此向下移动慢。内，因此向下移动慢。l l凝胶物质：凝胶物质：凝胶物质：凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶
16、、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。（5）亲和层析）亲和层析l l原理：原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。l l专一亲和力分子对：专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、酶与底物、特异性抗原与抗体、酶与底物、特异性抗原与抗体、酶与底物、特异性抗原与抗体、DNADNA和和和和RNARNA、激素和其受体、激素和其受体、激素和其受体、激素和其受体l l载体：载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。多孔玻璃。多孔玻璃。多孔玻璃。品名规格数量价格烧杯250ml150ml1量筒50ml1试管15试管架1试管刷1洗耳球1研钵1滴管2木夹1吸量管0.5ml21ml22ml25ml110ml1生化实验仪器清单生化实验仪器清单