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1、实验细胞器分离第1页，本讲稿共11页目的要求目的要求(1)初步掌握细胞器的分离原理及一般方法。(2)学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法n实验二实验二.细胞器的分离细胞器的分离第2页，本讲稿共11页实验原理实验原理 n 细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。n 分级分离方法有两种，即：差速离心法和密度梯度离心法。第3页，本讲稿共11页差速离心差速离心：采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。被分离的分子越小，需要的离心速度越高。大颗粒首先沉到管底较小颗粒沉降第4页，本讲稿共11页速度区带分离法：速度区带分离法：预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油），利用各种
2、颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同一梯度层内。注：待分离颗粒密度比介质密度都要大：不能离心太久，否则两种颗粒都会沉到底部第5页，本讲稿共11页内容与方法内容与方法内容：内容：大鼠肝细胞细胞核及线粒体的分离大鼠肝细胞细胞核及线粒体的分离第6页，本讲稿共11页方法：方法：(3)(3)过滤：过滤：将组织匀浆完毕，用尼龙网过滤，每组取2ml的过滤液移入离心管中。(2)(2)匀浆匀浆:每组取适量剪碎组织，放入匀浆器中,加入3ml的0.25mol/L蔗糖溶液进行匀浆。(1)(1)取材：取材：将饥饿24h的大白鼠处死。迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水，洗去血污，滤纸吸干。在小烧杯中
3、剪碎，用少量0.25mo1/L蔗糖液洗涤数次。第7页，本讲稿共11页(4)(4)离心：离心：第一次:1000rpm 1000rpm,8min。(5)(5)纯化：纯化：在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2至2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入2ml 的0.88mo1/L蔗糖蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2溶液。尽量使两种溶液明显分层。2000rpm2000rpm离心15min。加0.25M蔗糖至4ml，混匀第二次:1300rpm1300rpm,8min。弃上清上清保留于试管1.0处重复一次第8页，本讲稿共11页（7 7）镜检：）镜检：观察先
4、用低倍镜。再用高倍镜观察先用低倍镜。再用高倍镜 (6)(6)细胞核鉴定：细胞核鉴定：。涂片,空气干燥浸入95的乙醇溶液5min，晾干滴加甲基绿-派洛宁染液染色12min分色:快速放入丙酮中，记时90秒,用吸管吸水冲洗，擦干水分固定：染色：悬浮：在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混匀第9页，本讲稿共11页线粒体的分离将分离细胞核时收集的上清液以将分离细胞核时收集的上清液以11400离心离心10分钟分钟,弃去弃去上清上清,沉淀用预冷沉淀用预冷0.25mol/l的蔗糖溶液悬浮至离心管的蔗糖溶液悬浮至离心管1.0处处,11400g离心离心10min,去上清。去上清。鉴定鉴定:在干净的载玻片中央在干净的载玻片中央,用牙签挑取沉淀物均匀涂片用牙签挑取沉淀物均匀涂片.滴滴加加1滴中性红滴中性红-詹母绿染液染色詹母绿染液染色15 min,盖上盖玻片盖上盖玻片,镜检镜检.被染成亮绿色的即为线粒体被染成亮绿色的即为线粒体.第10页，本讲稿共11页 思考题思考题 本次实验中用了哪些离心方法，原理是什本次实验中用了哪些离心方法，原理是什么？么？1、染色时间要充分。、染色时间要充分。2、丙酮分色时要迅速，以防细胞核脱色。、丙酮分色时要迅速，以防细胞核脱色。注意事项注意事项注意事项注意事项第11页，本讲稿共11页