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1、第六章第六章 人工模拟酶人工模拟酶Chapter 6 Artifical Enzymeo模拟酶的概念及理论基础模拟酶的概念及理论基础o模拟酶的分类模拟酶的分类o抗体酶抗体酶o印迹酶印迹酶Contents一、模拟酶的概念一、模拟酶的概念o人工（模拟）酶：根据酶的催化原理，模拟酶人工（模拟）酶：根据酶的催化原理，模拟酶的生物催化功能，用的生物催化功能，用有机化学有机化学和和生物学生物学的方法的方法合成具有专一催化功能的物质。合成具有专一催化功能的物质。n酶学基础：酶学基础：酶的结构和酶学性质。酶的结构和酶学性质。n“主主-客体客体”化学：化学：主体有选择地识别客体并与之通过弱相主体有选择地识别客体
2、并与之通过弱相互作用力形成稳定复合物的化学领域。互作用力形成稳定复合物的化学领域。n超分子化学：超分子化学：研究两种或两种以上的化学物通过分子间力研究两种或两种以上的化学物通过分子间力（静电作用、氢键、范德华力等非共价键）相互作用缔结而成（静电作用、氢键、范德华力等非共价键）相互作用缔结而成的具有特定结构和功能的超分子体系的科学。的具有特定结构和功能的超分子体系的科学。二、模拟酶的理论基础二、模拟酶的理论基础o美国加州大学洛杉矶分校的克拉姆美国加州大学洛杉矶分校的克拉姆(Donald James Cram)教授和法教授和法国路易国路易巴斯德大学的莱恩巴斯德大学的莱恩(JeanMarie Leh
3、n)教授由于分别创立教授由于分别创立了了“主主客体化学客体化学”(HostGuest Chemistry)和和“超分子化学超分子化学”(Supra molecular Chemistry)而荣获而荣获1987年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。o克拉姆的克拉姆的“主主客体化学客体化学”的基本思想是：具有的基本思想是：具有显著显著“识别能力识别能力”的某些冠醚可以作为的某些冠醚可以作为“主体主体”，有，有选择性地与作为选择性地与作为“客体客体”的底物的底物发生配合发生配合。克拉姆的意图旨在模拟酶和底物的作用。克拉姆的意图旨在模拟酶和底物的作用。o莱恩的莱恩的“超分子化学超分子化学”的主要内容是：
4、首先要求合成具有的主要内容是：首先要求合成具有特定结构特定结构的分子作为接受体。接受体应具有的分子作为接受体。接受体应具有选择选择络合离子和分子结构形式的络合离子和分子结构形式的能力，又使底物可借各种分子内作用（电性作用、磁性作用、氢键、能力，又使底物可借各种分子内作用（电性作用、磁性作用、氢键、范德华力以及各种近距离子）与受体结合，这样，就导致范德华力以及各种近距离子）与受体结合，这样，就导致“分子的分子的聚集聚集”，这种聚集后的分子莱恩称其为，这种聚集后的分子莱恩称其为“超分子超分子”。o“超分子化学超分子化学”就是分子内键合和分子聚合的化学。就是分子内键合和分子聚合的化学。“超分子超分子
5、”兼兼有分子设别，分子催化和选择性迁移有分子设别，分子催化和选择性迁移等功能。等功能。“主主客体化学客体化学”和和“超分子化学超分子化学”的共同意图就是说明酶和底物这间的作用就象一把的共同意图就是说明酶和底物这间的作用就象一把钥匙开一把锁一样。钥匙开一把锁一样。o 催化剂是一种选择性极强的反应中的第三者。催化剂与反应催化剂是一种选择性极强的反应中的第三者。催化剂与反应物及产物之间有一种严格的微妙的关系。首先，催化剂与反应物及产物之间有一种严格的微妙的关系。首先，催化剂与反应物之间必须建立起物之间必须建立起“主主客体客体”关系。关系。“主主客体客体”关系的建关系的建立需要苛刻的条件，不仅要从电子
6、结构上去考虑，而且还要从立需要苛刻的条件，不仅要从电子结构上去考虑，而且还要从空间结构上去考虑。空间结构上去考虑。“主主客体客体”关系一旦得到建立，就说明关系一旦得到建立，就说明催化剂这把催化剂这把“钥匙钥匙”已经识别了反应物这把已经识别了反应物这把“锁锁”了。但如何了。但如何去开这把去开这把“锁锁”，并把，并把“钥匙钥匙”原封不动地抽出来，还需要原封不动地抽出来，还需要“超分子超分子”。n简单模拟：简单模拟：模拟物只含有与生物活性酶相同的因子。模拟物只含有与生物活性酶相同的因子。n模拟酶活性中心结构：模拟酶活性中心结构：空腔的大环化合物作为底物识别部空腔的大环化合物作为底物识别部位，在边缘衍
7、生催化基团。位，在边缘衍生催化基团。n整体模拟：整体模拟：高级模拟，需要考虑识别和催化部位的协同性。高级模拟，需要考虑识别和催化部位的协同性。模拟酶的研究内容模拟酶的研究内容三、模拟酶的分类三、模拟酶的分类1.根据根据Kirby分类法分类法n以模拟酶活性中心为基础的酶模型：以模拟酶活性中心为基础的酶模型：化学方法通过天然酶活化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性；性的模拟来重建和改造酶活性；n机理酶模型：机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成；定化的认识，来指导酶模型的设计和合成；n单纯合成的酶样
8、化合物：单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。单分子。n主主-客体模拟酶客体模拟酶n胶束酶胶束酶n肽酶肽酶n半合成酶半合成酶n聚合物人工酶聚合物人工酶n分子印迹酶分子印迹酶n抗体酶抗体酶2.2.按照模拟酶的属性按照模拟酶的属性（1 1）主）主-客体模拟酶客体模拟酶o环糊精酶环糊精酶o合成的主合成的主-客体酶客体酶o 天然存在的、类似酶的理想宿主分子，本身具有酶模型的天然存在的、类似酶的理想宿主分子，本身具有酶模型的特性。略呈锥形的圆筒结构，外侧亲水，其羟基可与多种客体特性。略呈锥形的圆筒结构，外侧亲水，其羟基可与多种客体形成氢键，内侧的空腔具
9、有疏水性，能包结多种客体分子，类形成氢键，内侧的空腔具有疏水性，能包结多种客体分子，类似酶对底物的识别。似酶对底物的识别。o 人工合成的宿主分子，具有酶模型的特性。如冠醚、人工合成的宿主分子，具有酶模型的特性。如冠醚、穴醚、环番、穴醚、环番、杯芳烃杯芳烃等大环多齿配体。具有底物识别能等大环多齿配体。具有底物识别能力和催化基团。力和催化基团。o 冠醚最大的特点就是能与正离子，尤其是与碱金属冠醚最大的特点就是能与正离子，尤其是与碱金属离子络合，并且随环的大小不同而与不同的金属离子络离子络合，并且随环的大小不同而与不同的金属离子络合。合。o 例如，安息香在水溶液中的缩合反应产率极低，如果例如，安息香
10、在水溶液中的缩合反应产率极低，如果在该水溶液中加入在该水溶液中加入7的冠醚，则可得到产率为的冠醚，则可得到产率为78的的安息香；若上一反应在苯（或乙腈）中进行。如果加入安息香；若上一反应在苯（或乙腈）中进行。如果加入18冠冠6，产率可高达，产率可高达95。o1942年金克年金克(Zinke，奥地利，奥地利)首次首次合成合成得到，因其结构像一个得到，因其结构像一个酒酒杯杯而被古奇而被古奇(C.D.Gutscht，美国，美国)称为杯芳烃。称为杯芳烃。o绝大多数的杯芳烃熔点较高，在绝大多数的杯芳烃熔点较高，在250以上。在常用的有机以上。在常用的有机溶剂中的溶解度很小，几乎不溶于水。杯芳烃具有大小可
11、调节溶剂中的溶解度很小，几乎不溶于水。杯芳烃具有大小可调节的的“空腔空腔”，能够形成主，能够形成主-客复合物，与客复合物，与环糊精环糊精、冠醚冠醚相比，是相比，是一类更具广泛适应性的一类更具广泛适应性的模拟酶模拟酶，被称为继冠醚和环糊精之后的，被称为继冠醚和环糊精之后的第三代主体化合物。第三代主体化合物。杯芳烃杯芳烃 作为第三代主体超分子化合物，杯芳烃具有独特的空穴结构，作为第三代主体超分子化合物，杯芳烃具有独特的空穴结构，与冠醚和环糊精相比具有如下特点：与冠醚和环糊精相比具有如下特点：它是一类合成的低聚物，它的空穴结构大小的调节具有较大的它是一类合成的低聚物，它的空穴结构大小的调节具有较大的
12、自由度；自由度；通过控制不同反应条件及引入适当的取代基，可固定所有需要通过控制不同反应条件及引入适当的取代基，可固定所有需要的构象；的构象；杯芳烃的衍生化反应，不仅在杯芳烃下缘的酚羟基、上缘的苯杯芳烃的衍生化反应，不仅在杯芳烃下缘的酚羟基、上缘的苯环对位，而且连接苯环单元的亚甲基都能进行各种选择性功能化，环对位，而且连接苯环单元的亚甲基都能进行各种选择性功能化，这不仅能改善杯芳烃自身水溶性差的不足，而且还可以改善其分子这不仅能改善杯芳烃自身水溶性差的不足，而且还可以改善其分子络合能力和模拟酶活力；络合能力和模拟酶活力；杯芳烃的热稳定性及化学稳定性好，可溶性虽较差，但通过衍生杯芳烃的热稳定性及化
13、学稳定性好，可溶性虽较差，但通过衍生化后，某些衍生物具有很好的溶解性；化后，某些衍生物具有很好的溶解性；杯芳烃能与离子和中性分子形成主一客体包结物，这是集冠醚杯芳烃能与离子和中性分子形成主一客体包结物，这是集冠醚和环糊精两者之长；和环糊精两者之长；杯芳烃的合成较为简单，可望获得较为廉价的产品，事实上现杯芳烃的合成较为简单，可望获得较为廉价的产品，事实上现在已有多种杯芳烃商品化。在已有多种杯芳烃商品化。表面活性剂分子在水溶液中超过一定浓度可聚集成表面活性剂分子在水溶液中超过一定浓度可聚集成胶束。胶束在水溶液中提供了疏水微环境胶束。胶束在水溶液中提供了疏水微环境，可对底物，可对底物进行包络进行包络
14、，类似于酶结合部位。若再将一些催化基团，类似于酶结合部位。若再将一些催化基团如：咪唑、硫醇、羟基和一些辅酶共价或非共价地连接如：咪唑、硫醇、羟基和一些辅酶共价或非共价地连接或附着在胶束上或附着在胶束上，相当于酶活性中心，相当于酶活性中心，就构成具有催，就构成具有催化活性的胶束模拟酶。化活性的胶束模拟酶。（2 2）胶束酶）胶束酶o胶束模拟酶一方面利用增溶、增稳的增效作用，使酶胶束模拟酶一方面利用增溶、增稳的增效作用，使酶活性呈现活性呈现“超级活性超级活性”。另一方面，利用胶束介质。另一方面，利用胶束介质（尤其是反相胶束介质）模拟天然酶在生物体内活体（尤其是反相胶束介质）模拟天然酶在生物体内活体细
15、胞中的微环境。细胞中的微环境。XX 胶束酶胶束酶XXXXXXX（3 3）肽酶）肽酶o 模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。多肽。1977年年Dhar等人报道，人工合成的等人报道，人工合成的GluPheAlaGluGluAlaSerPhe八肽具有溶菌酶的活八肽具有溶菌酶的活性。其活性为天然溶菌酶的性。其活性为天然溶菌酶的50%.（4 4）半合成酶）半合成酶o具有催化活性的金属或金属有机物与具有特异性的蛋白具有催化活性的金属或金属有机物与具有特异性的蛋白质相结合。质相结合。o具有特异性的物质与具有催化活力的酶相结合。具有特异性的物质与具有催
16、化活力的酶相结合。o具有催化活性的金属或金属有机物与具有特异性的蛋白具有催化活性的金属或金属有机物与具有特异性的蛋白质相结合。质相结合。o具有特异性的物质与具有催化活力的酶相结合。具有特异性的物质与具有催化活力的酶相结合。p合成高分子作为支撑物构筑酶的活性中心。合成高分子作为支撑物构筑酶的活性中心。（5 5）聚合物人工酶）聚合物人工酶一、什么是分子印迹技术一、什么是分子印迹技术？分子印迹技术是二十世纪八十年代迅速发展起来分子印迹技术是二十世纪八十年代迅速发展起来的一种化学分析技术，属于泛分子化学研究范畴，的一种化学分析技术，属于泛分子化学研究范畴，通常被人们描述为创造与识别通常被人们描述为创造
17、与识别“分子钥匙分子钥匙”的人工的人工“锁锁”技术。技术。（6 6）印记酶）印记酶 分子印记技术是在分子识别基础上开展的。分子印记技术是在分子识别基础上开展的。分子识别分子识别本质上是指主体分子本质上是指主体分子(受体受体)对客体分子对客体分子(底物底物)选择性结合并产生某种特定功能的过程。如：酶选择性结合并产生某种特定功能的过程。如：酶与底物、抗原与抗体、糖与蛋白质等的相互作用。与底物、抗原与抗体、糖与蛋白质等的相互作用。以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子出去后，此聚合物就留下了此分子相匹配模板分子出去后，此聚合物就留下了此分子相匹配
18、的空穴，这种聚合物就像的空穴，这种聚合物就像“锁锁”一样对模板分子具一样对模板分子具有选择性识别作用，这种技术被称为有选择性识别作用，这种技术被称为分子印记分子印记。二、分子印记的原理二、分子印记的原理 特定分子（印迹分子或称模板）与带有官能团的特定分子（印迹分子或称模板）与带有官能团的单体分子接触时，会尽可能同单体官能团形成多重作单体分子接触时，会尽可能同单体官能团形成多重作用点，聚合后，这种作用就会被固定下来。当模板分用点，聚合后，这种作用就会被固定下来。当模板分子被除去后，聚合物中就形成了与模板分子在空间上子被除去后，聚合物中就形成了与模板分子在空间上互补的具有多重作用位点的结合部位，这
19、样的结合部互补的具有多重作用位点的结合部位，这样的结合部位对模板分子可产生多重相互作用，因而对此印记分位对模板分子可产生多重相互作用，因而对此印记分子具有特异性结合能力。子具有特异性结合能力。分子印迹原理图分子印迹原理图（1 1）分子印记的概念分子印记的概念 分子印记分子印记（molecular imprinting）是指制备对某一是指制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。化合物具有选择性的聚合物的过程。这个化合物叫印记分子这个化合物叫印记分子（print molecule，P），或，或称为模板分子称为模板分子（template，T）。四、影响分子印迹选择性识别的因素四、影响分子印迹选择性
20、识别的因素o底物结构和印记分子的互补性：底物结构和印记分子的互补性：底物必须与印记分子的结构、底物必须与印记分子的结构、大小相似，否则影响分辨率。大小相似，否则影响分辨率。o聚合物与印记分子之间的作用力：聚合物与印记分子之间的作用力：作用力是影响分辨率的作用力是影响分辨率的重要因素，若能产生多种相互作用力，且键的数目有多，则分辨重要因素，若能产生多种相互作用力，且键的数目有多，则分辨率提高。率提高。o交联剂的类型和用量：交联剂的类型和用量：一般一般80%以上交联度。交联度小，则以上交联度。交联度小，则难限定负责选择部位的形状和其中的基团取向，导致分辨率下降。难限定负责选择部位的形状和其中的基团
21、取向，导致分辨率下降。o聚合条件：聚合条件：低温聚合可稳定印记分子和单体间的复合物。低温聚合可稳定印记分子和单体间的复合物。五、分子印记聚合物的制备方法五、分子印记聚合物的制备方法n选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应；选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应；n在印迹分子在印迹分子-单体复合物周围发生聚合反应；单体复合物周围发生聚合反应；n用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。一般来说，一般来说，聚合物空穴对印记分子的特异性结聚合物空穴对印记分子的特异性结合主要由官能团的排列决定，空穴的形状处于次合主要由官能团的排列决定，空穴的形状处于次要地位要地位。（3
22、3）分子印记的类型分子印记的类型 在在某些载体表面某些载体表面产生分子印记空腔或进行产生分子印记空腔或进行表面修饰产生印记结合部位的过程称为表面修饰产生印记结合部位的过程称为表面分表面分子印记子印记。n 表面分子印迹表面分子印迹表面分子印迹包括：表面分子印迹包括：1无机物为载体的表面印迹无机物为载体的表面印迹2固体材料的表面修饰固体材料的表面修饰3蛋白质的表面印迹蛋白质的表面印迹 蛋白质表面印迹蛋白质表面印迹在聚合物涂层的硅石上的示意图在聚合物涂层的硅石上的示意图n 生物印记生物印记 指以指以天然的生物材料天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对
23、印迹分子为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。具有特异性识别空腔的过程。天然生物材料（如蛋白质）含有丰富的氨基酸残基，天然生物材料（如蛋白质）含有丰富的氨基酸残基，它们与印记分子能产生很好的识别作用。它们与印记分子能产生很好的识别作用。2.2.生物印迹生物印迹n1生物印迹：指以天然的生物材料，如蛋白质生物印迹：指以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。n2有机相生物印迹酶有机相生物印迹酶 能不能利用分子能不能利用分子印记技术
24、来制备人工印记技术来制备人工酶呢？酶呢？（5）分子印记酶）分子印记酶 通过分子印记技术可以产生类似于酶的活性中心通过分子印记技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。n定义定义六、分子印迹酶六、分子印迹酶n通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物
25、定向排列。的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。n性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。选择选择底物、底物、底物类似物、底物类似物、抑制剂、过渡抑制剂、过渡态类似物态类似物等作等作为印记分子。为印记分子。o竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。o酶蛋白分子在有机相中具有对配体的酶蛋白分子在有机相中具有对配体的
26、“记忆记忆”功能。功能。分子印记酶的原理：分子印记酶的原理：主主-客体酶模型客体酶模型n 影响分子印记酶选择性识别的因素影响分子印记酶选择性识别的因素o底物结构和印记分子的互补性；底物结构和印记分子的互补性；o聚合物与印记分子之间的作用力；聚合物与印记分子之间的作用力；o交联剂的类型和用量：交联剂的类型和用量：一般一般80%以上交联度。以上交联度。o聚合条件聚合条件 1.1.色谱分离色谱分离 最广泛的应用之一是利用其特异的识别功能去分最广泛的应用之一是利用其特异的识别功能去分离混合物。其适用的印迹分子范围广，无论是小分子离混合物。其适用的印迹分子范围广，无论是小分子(如氨基酸、药品和碳氢化合物
27、等如氨基酸、药品和碳氢化合物等)还是大分子还是大分子(如蛋如蛋白质等白质等)已被应用于各种印迹技术中。已被应用于各种印迹技术中。应用：应用：2 2 固相萃取固相萃取 通常样品的制备都包括溶剂萃取，由于分子印迹通常样品的制备都包括溶剂萃取，由于分子印迹技术的出现，这可以用固相萃取代替，并且可利用分技术的出现，这可以用固相萃取代替，并且可利用分子印迹聚合物选择性富集目标分析物。由于印迹聚合子印迹聚合物选择性富集目标分析物。由于印迹聚合物即可在有机溶剂中使用，又可在水溶液中使用，故物即可在有机溶剂中使用，又可在水溶液中使用，故与其他萃取过程相比，具有独特的优点。与其他萃取过程相比，具有独特的优点。印
28、迹分子的强度与选择性在一定程度上可以和抗印迹分子的强度与选择性在一定程度上可以和抗原与抗体之间的作用相媲美，因而可用于抗体模拟原与抗体之间的作用相媲美，因而可用于抗体模拟,这这种模拟抗体制备简单、成本低，在高温、酸碱及有机种模拟抗体制备简单、成本低，在高温、酸碱及有机溶剂中具有较好的稳定性，此外还可以重复使用。溶剂中具有较好的稳定性，此外还可以重复使用。3.3.天然杭体模拟天然杭体模拟o缺乏酶的柔性，催化效率不高；缺乏酶的柔性，催化效率不高；o单体与模板之间形成的次级作用力小，影响聚合物对反应底物的单体与模板之间形成的次级作用力小，影响聚合物对反应底物的识别能力。识别能力。n 分子印记酶的局限
29、性分子印记酶的局限性o酶蛋白分子在酶蛋白分子在有机相中具有对配体的有机相中具有对配体的“记忆记忆”功能功能。生物印记酶的原理：生物印记酶的原理：（6 6）生物印记酶生物印记酶 生物大分子生物大分子在有机溶剂中刚性增强在有机溶剂中刚性增强，保持其在水溶液中与底物结合，保持其在水溶液中与底物结合的活性构象。的活性构象。o生物大分子作为被印记的宿主，印记酶的活性中心更接近于天然生物大分子作为被印记的宿主，印记酶的活性中心更接近于天然酶，催化效率高。酶，催化效率高。o宿主与印记分子之间形成的次级作用力大，增强了印记酶对底物宿主与印记分子之间形成的次级作用力大，增强了印记酶对底物的识别力。的识别力。n 生物印记酶的优势：生物印记酶的优势：1.1.简单模拟向高级模拟发展；简单模拟向高级模拟发展；2.2.开发更多可多部位结合且多重识别功能的模拟酶；开发更多可多部位结合且多重识别功能的模拟酶；3.3.将天然酶改造成新酶；将天然酶改造成新酶；4.4.人工酶在分析、医药、工业上的应用。人工酶在分析、医药、工业上的应用。四、人工酶的研究进展四、人工酶的研究进展1.1.模拟酶的概念及理论基础模拟酶的概念及理论基础2.2.模拟酶的分类模拟酶的分类3.3.分子印记酶的定义及分子印记酶的定义及影响分子印记酶选择性识别影响分子印记酶选择性识别的因素的因素4.4.生物印记酶的原理生物印记酶的原理本章重点本章重点