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1、 第四章第四章 细胞工程制药细胞工程制药 细胞工程药物细胞工程药物第一节、第一节、动物细胞工程制药基本技术动物细胞工程制药基本技术及及实例实例第二节、第二节、植物细胞工程制药基本技术植物细胞工程制药基本技术及及实例实例作业 分别列出1种动物细胞、植物细胞工程制药的实例细胞工程n指以细胞为研究对象，通过细胞培养获得自然界难以获得的珍贵产品的新兴生物技术。微生物、动物、植物细胞培养特性细胞种类微生物细胞植物细胞动物细胞细胞大小（um）1102030010100倍增时间（h）0.35大于12大于15营养要求简单复杂复杂对剪切力不敏感敏感敏感光照要求不要求要求不要求主要产物氨基酸、抗生素、核苷酸、有机
2、酸色素、次生代谢产物疫苗、抗体、多肽动物细胞工程药物n适合真核表达的的药物蛋白或亚单位疫苗n单克隆抗体n药物筛选模型植物细胞工程药物次生代谢产物药用成分萜类单萜龙脑倍半萜青蒿素二萜紫杉醇三萜人参皂苷四萜番茄红素多萜杜仲胶甾体类薯蓣皂苷酚类简单丙烷类丹参素香豆素类甘草香豆素木脂素类厚朴酚苯醌类连翘苷萘醌类胡桃醌蒽醌类金丝桃素菲醌类丹参醌黄酮类甘草黄酮鞣质（单宁）木麻黄宁含氮化合物生物碱喜树碱第一节、动物细胞工程制药基本技术第一节、动物细胞工程制药基本技术一、动物细胞培养技术：一、动物细胞培养技术：概述概述、仪器设备仪器设备、培养基培养基、培养方法培养方法、种质保存种质保存、大规模培养技术大规模培
3、养技术二、动物细胞二、动物细胞 融合技术融合技术及单克隆抗体制备（略）及单克隆抗体制备（略）三、转基因动物技术（略）三、转基因动物技术（略）四、核移植及动物克隆技术（略）四、核移植及动物克隆技术（略）五、干细胞技术（略）五、干细胞技术（略）动物细胞方法动物细胞方法（一）（一）组织块培养法组织块培养法（二）（二）细胞单层培养法细胞单层培养法（三）（三）单细胞微量板克隆技术单细胞微量板克隆技术动物细胞培养概述动物细胞培养概述n动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养是从动物体内取出细是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营菌、适温和丰
4、富的营养条件下，使离体细养条件下，使离体细胞或者组织生存、生胞或者组织生存、生长并维持结构和功能长并维持结构和功能的一门技术。的一门技术。培养细胞的特性培养细胞的特性悬浮型血液、淋巴细胞、杂交瘤细胞贴壁型：A上皮细胞型B成纤维细胞型C游走细胞型D多形细胞形（1）动物细胞贴壁生长特性（2）动物细胞接触抑制特性兼性贴壁型：动物培养细胞的动物培养细胞的优点优点（1 1）细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。（2 2）理化环境可控制，培养物可直接被观测。理化环境可控制，培养物可直接被观测。（3 3）提供大量均一的细胞供制备用。提供大量均一的细胞供制备用
5、。（4 4）便于进行人工筛选。便于进行人工筛选。（5 5）结合结合显微显微电影技术，可观察细胞代谢活动和反应。电影技术，可观察细胞代谢活动和反应。应用：应用：（1 1）生产有重要价值的蛋白质产品）生产有重要价值的蛋白质产品 分泌性的蛋白质产品分泌性的蛋白质产品（2 2）培养皮肤细胞用于移植）培养皮肤细胞用于移植 形成组织形成组织（3 3）检测有毒物质）检测有毒物质 致癌致畸引起染色体数目和结构改变致癌致畸引起染色体数目和结构改变 （4 4）理论研究）理论研究 培养正常或异常细胞用于生理、病理、药理研究培养正常或异常细胞用于生理、病理、药理研究（1）动物细胞贴壁生长特性（2）动物细胞接触抑制特性
6、n细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。动物细胞培养所需动物细胞培养所需仪器设备仪器设备实验室要求实验室要求（A）和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等，入内换上。（B）室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥.万级。（C）侧部可设传递窗，用于物品传递。（D）有消毒用紫外线灯（1 1）培养器具培养器具（2 2）超净工作台超净工作台（3 3）COCO2 2培养箱培养箱（4 4）倒置显微镜倒置显微镜（5 5）纯化水装置纯化水装置（1 1）培养器具）培养器具培养瓶培养瓶培养板培养板培养皿培养皿（2）超净工作台）超净工作台超净工作台的工作原理是超净工作台的工作原理
7、是利用鼓风机驱动空气遁利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得的尘埃颗粒，使空气得到净化。到净化。100100级超净工作台指标：级超净工作台指标：（0.5m3.50.5m3.5粒粒/L/L）（3 3）COCO2 2培养箱培养箱CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2。二氧化碳的作用：细胞生长需要、维持pH值。（4 4）倒置显微镜）倒置显微镜 （5 5）纯化水装置）纯化水装置动物细胞的培养基动物细胞的培养基n动物细胞的培养基组成-氨基酸、葡萄糖、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素、缓冲系统。1、培养细胞的培养液要求2、天然培养基3、
8、合成培养基4、无血清培养基1 1、培养细胞的生存环境、培养细胞的生存环境适宜的温度-人和哺乳动物培养细胞最适温度均为3537。气体环境和氢离子浓度-需要一定量的O2和CO2（95空气+5%CO2）；pH7.2-7.4 营养物质-适当的培养基环境无毒和无菌：双抗、消毒渗透压：培养液要求培养液要求氨基酸-氮源盐类-钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，氯离子，硫酸根离子，磷酸根离子，碳酸氢根离子等 葡萄糖：供能 缓冲系统-CO2缓冲系统或HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）生长因子-PDGF，EGF，FGF等 其它成分-维生素，矿物，有机补充物，激素等平衡盐溶液（平衡盐溶液（BSSBSS）功效：维持渗透压提
9、供缓冲系统提供水分和无机盐 4、天然培养基天然培养基天然培养基如-血清，血浆，组织浸出液等优点-营养成分丰富，培养效果好缺点-来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染天然培养基的类型：A乳蛋白水解物培养基B酪蛋白水解物培养基C血清及胚胎浸出液培养基5、合成培养基合成培养基合成培养基-是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。优点-标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点-缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。目前常用合成培养基血清来培养细胞合成培养基的类型：（A）Eagle培养
10、基（内含13种氨基酸、9种维生素、多种无机盐）（B）Ham氏F10培养基（内含20种氨基酸、多种维生素、10种无机盐）（C）199培养基（D）Waymouth氏MB752/1培养基（E）NCTC109培养基6、无血清培养基无血清培养基-在合成培养基中加入起血清作用的种类激素和生长因子，如铁转运蛋白、乙醇胺、胰岛素、硒、氢化可的松、维生素C、促胃激素等等。血清的成分：激素：胰岛素、胰高血糖素、生长激素、孕酮、氢化可的松、雌二醇等生长因子：表皮生长因子、神经生长因子、成纤维生长因子、血小板生长因子结合蛋白：白蛋白、转铁蛋白等贴壁和铺展因子物质：如纤维粘连素、多聚赖氨酸、胶原、血清铺展因子等。多种金
11、属离子低分子量营养因子：维生素A、维生素C、脂肪酸等不明成分动物组织块培养法动物组织块培养法n将动物组织切成直径为12mm的小块、并且进行培养的方法称为动物组织块培养法。有些动物组织如人的皮肤细胞，由于分散成细胞十分困难，因此常常采用组织块培养法。n动物组织块固着之后，加培养液，于37、CO2培养箱中、通入含5%CO2的空气进行培养，即可在组织块周围长出新的细胞单层。动物组织培养过程中，进行旋转或者振荡，培养效果更好。动物细胞单层培养法动物细胞单层培养法n动物组织块经过胰蛋白酶消化分散成单细胞或者细胞团块之后，粘附于培养基中，培养成新生细胞单层的方法称为动物细胞单层培养法。n动物细胞单层培养法
12、包括二个过程：1、组织块分散成单细胞组织块分散成单细胞2、培养培养1、组织块分散成单细胞、组织块分散成单细胞n消化分散组织块的方法分为三种：（1）酶消化法酶消化法（2）物理分散法）物理分散法（3）酶消化与物理分散结合法）酶消化与物理分散结合法2、培养、培养n上述细胞悬液经过计数、稀释之后，接种于无菌培养器中，加入培养液于37条件下培养，细胞即粘于瓶底或者转瓶内壁，并且开始生长形成单层。n接种浓度：上皮细胞1*1053*105个/毫升。成纤维细胞2*1056*105个/毫升。成体细胞应高于胚胎细胞。n培养时间：上皮细胞57天形成单层。成纤维细胞34天形成单层。n培养条件：动物细胞的需氧量较低，一
13、般通入含5%CO2的空气进行供氧，有利于维持培养基的PH值。n培养方法（1）原代培养（2）传代培养（1 1）原代培养）原代培养定义：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续14周。原代细胞：直接将动物组织和器官经过粉碎、消化而制得的悬浮细胞步骤：取材-组织分离原代细胞-培养（2）传代培养传代培养定义：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。注意：原代细胞类型不一，利用不同的消化时间和消化液。细胞系-原代培养物首次传代成功后即成细胞系。A有限细胞系：传代细胞系 B连续细胞系：转化细胞系传代细胞系传代细胞系：又称：又称二倍体细胞系二倍体细胞系，
14、原代细胞经过传代、筛选、克隆等步骤，从多，原代细胞经过传代、筛选、克隆等步骤，从多种细胞中纯化得到的某种具有一定特征的细胞系。种细胞中纯化得到的某种具有一定特征的细胞系。步骤：步骤：AA贴壁细胞：去除培养基贴壁细胞：去除培养基-胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化-加入培养液，形成细胞悬液加入培养液，形成细胞悬液-稀稀释传代细胞系释传代细胞系-培养培养BB悬浮细胞：收集细胞悬液悬浮细胞：收集细胞悬液-离心搜集细胞离心搜集细胞-用培养液稀释用培养液稀释-稀释传代细胞稀释传代细胞系系-培养培养传代细胞：传代细胞：（1 1）具有二倍性染色体）具有二倍性染色体（2n2n），），染色体核型正常。染色体核型正常。（2
15、 2）具有明显的贴壁依赖、接触一致性）具有明显的贴壁依赖、接触一致性（3 3）培养条件下一般可联系传代）培养条件下一般可联系传代5050代，不能进行无限期的分裂繁殖。代，不能进行无限期的分裂繁殖。（4 4）无致癌性。）无致癌性。目前已获得了多种人胚胎肺二倍体细胞，来源于目前已获得了多种人胚胎肺二倍体细胞，来源于3-43-4个月的胚胎肺组织，如：个月的胚胎肺组织，如：W1-38W1-38；MRC-5MRC-5；MRC-9MRC-9；IMR-90IMR-90；2BS2BS；KBM-13KBM-13；LS-7LS-7n转化细胞系：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖能力的细胞系
16、。n特征：原代细胞相比，其形态、染色体结构、倍增时间、营养要求、生理生化特性、病毒敏感性、抗原性、上均发生了变化，并且具有致癌性。n来源：自然转化；人为转化；肿瘤组织n目前已经获得的确立细胞系有：nABHK-21细胞 地鼠幼鼠肾脏nBHela细胞 人子宫癌细胞nCVero细胞 非洲绿猴肾脏细胞nDCHO细胞 中国仓鼠卵巢细胞nENamalwa细胞 肯尼亚淋巴瘤病人 转化细胞系单细胞分离培养单细胞分离培养n单细胞分离培养也称为细胞克隆培养，是指将单个细胞培养成纯细胞系群的技术。n由于动物细胞具有集群效应，单个细胞在培养基中难以生长。因此在克隆株培养过程中，常常采用：（1）使用条件培养基进行培养。
17、（2）在培养基中加入饲养细胞-如加入小鼠胸腺细胞和小鼠腹腔巨噬细胞。单细胞微量板克隆技术单细胞微量板克隆技术1、微量板克隆技术微量板克隆技术2、单细胞微量板克隆技术的特点和应用单细胞微量板克隆技术的特点和应用1、微量板克隆技术、微量板克隆技术n微量板是指孔径为6mm，容量为0.3ml的多孔培养板。常用的有96孔、55孔、24孔。n细胞克隆时，将细胞稀释成10个/毫升以下的悬浮液，然后向每1微孔中加入0.1毫升，则每1孔中的细胞数平均为1个。接种后在含5%CO2的空气的培养箱中进行培养，每隔48天更换一次新的培养液0.2ml，直到形成单克隆细胞株。n继代培养时，吸除培养液，用不含Ca、Mg的平衡
18、盐溶液冲洗，再用胰蛋白酶进行消化，然后用培养液洗涤，再转移到25cm2表面的培养瓶中，加3ml培养液进行培养，几天后就会长成成片的新克隆细胞。2、单细胞微量板克隆技术的特点和应用、单细胞微量板克隆技术的特点和应用n微量板细胞克隆过程中，由于每一个克隆肯定来源于同一个细胞，其培养的重复性和可靠性均十分良好。n微量板细胞克隆技术可用于建立纯细胞株、检查细胞遗传性的一致性，还可用于分离细胞变种。n微量板细胞克隆技术在评价药物、毒物对细胞生长的影响、筛选淋巴细胞杂交瘤工程、基因和细胞工程、制备单克隆抗体工程中具有重要作用。动物细胞的种质保存技术动物细胞的种质保存技术1、种质保存的必要性、种质保存的必要
19、性（1）动物细胞在连续的继代培养中，容易污染和产生多种细胞混杂。（2）细胞株在继代培养过程中常常发生变异。（3）二倍体细胞存在寿命限制，无法进行大多的传代培养。2、保存形式、保存形式（1）组织块（2）细胞悬浮物（3）细胞单层培养物3、保存方法、保存方法4、超低温泠冻技术、超低温泠冻技术3、保存方法、保存方法n（1）常温法-将特定的动物细胞于20-30下进行保存的方法。如人羊膜细胞单层于28下可保存1个月。人肾细胞单层于25-30下可保存1个月以上。人二倍体细胞单层可保存二周，中间换液则可保存30天以上，n（2）低温法-将特定的动物细胞于4下进行保存的方法。如人胚组织块于4下可保存1430天。n
20、（3）超低温泠冻法-将特定的动物细胞于-70以下、或者在液氮中进行保存的方法。超低温泠冻法可以长期保存动物细胞，如二倍体细胞2BS自1973年来保存至今，其遗传性仍然没有变化。4、超低温泠冻技术、超低温泠冻技术（1）防冻剂防冻剂准备准备（2）超低温泠冻的具体方法超低温泠冻的具体方法（3 3）超低温泠冻后的解冻方法超低温泠冻后的解冻方法（1）防冻剂准备）防冻剂准备n超低温泠冻法需要使用防冻剂，以减少细胞在冻结过程中所受到的损伤。常用的防冻保护剂有：甘油、DMSO。A、甘油-毒性较小，能够结合水，减少组织结冰量，防止细胞内盐浓度升高，具有保护细胞的作用。其使用浓度一般为520%。B、DMSO-是目
21、前应用较多的一种保护剂，使用浓度为5-12.5%，与甘油相比，DMSO的毒性更低、抗冻能力更强。（2）超低温泠冻的具体方法）超低温泠冻的具体方法n先配制8-10%的DMSO+15-20%的小牛血清+适量NaHCO3的保护液将细胞培养物消化、分散、离心，收集单细胞按5*106个/ml的浓度添加保护液，1ml/支分装于安瓿瓶中0-4放置2-4小时-20放置2-4小时-702-4小时在液氮中进行保存（3 3）超低温泠冻后的解冻方法超低温泠冻后的解冻方法n将安瓿瓶取出，包裹4层纱布浸入40水中，振摇融化40秒混匀后立即接种到1-2瓶100ml的培养瓶中按1-2-4-8ml的方式依次加入生长液。最终加至
22、20ml。n注意事项A、保护液中含DMSO时，可直接用来接种。B、保护液含甘油时，应该离心除去甘油以防影响细胞增殖。动物细胞融合技术动物细胞融合技术n动物细胞融合技术-也称动物体细胞杂交技术，是指二个或者二个以上的动物细胞在外力作用下，合并为一个多核细胞的过程。n细胞膜蛋白质重新分布是细胞融合的基础。（一）（一）促融因素促融因素（二）（二）细胞之间的融合细胞之间的融合（三）（三）融合后杂种细胞的筛选技术融合后杂种细胞的筛选技术动物细胞融合动物细胞融合（一）促融因素（一）促融因素1、病毒诱导融合病毒诱导融合2、PEG诱导融合诱导融合3、电场诱导融合电场诱导融合4、其它诱导融合、其它诱导融合（1）
23、聚乙烯醇（2）离心力1、病毒诱导融合、病毒诱导融合n某些不同种属的动物细胞在特定病毒、病毒外壳或者病毒碎片的作用下，可以发生融合作用。如仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱疹病毒等。n当二种不同的动物细胞混合物中存在大量病毒时，病毒或其组分会在细胞间起粘连作用而使细胞聚集成团，细胞膜上的蛋白质和脂质双分子层产生重排、进而结合成一个整体。n病毒所诱导的融合是随机的，无法人为控制，同时融合率较低。2、PEG诱导融合诱导融合n当二种不同的动物细胞混合物中存在PEG时，就会产生细胞聚集作用。在除去PEG的过程中，即产生细胞融合现象。n所用的PEG分子量在1000-6000之间，一般浓度为40-50%
24、，在37下作用2-3分钟，其促融效果最佳。nPEG促融合的作用机理不清，其促融作用也具有随机性，无法人为控制。聚乙二醇聚乙二醇(PEG)PEG)法法n二种原生质体等量混合之后，加入聚乙二醇（PEG）进行融合。所使用的PEG分子量要求为1000-12000。再加入Ca、Mg。n最终浓度要求：PEG-30-40%MgCl2-20mmolCaCl2-50mmolPH=9.0n为了提高融合频度，同时可采用电诱导融合法、紫外线照射融合法。聚乙二醇法的步骤图示聚乙二醇法的步骤图示n融合液：含山梨醇融合液：含山梨醇或甘露醇，或甘露醇，CaCa2 2，K K。n诱导液：融合液诱导液：融合液20204545PE
25、GPEGn稀释液：含葡萄糖，稀释液：含葡萄糖，NaOHNaOH，甘氨酸等。甘氨酸等。3 3、电融合法电融合法n原理：原理：在直流电脉冲在直流电脉冲的诱导下，原生质体的诱导下，原生质体质膜表面电荷发生改质膜表面电荷发生改变，从而使原生质体变，从而使原生质体粘合并发生质膜瞬间粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接闭合破裂，进而连接闭合形成融合体。形成融合体。电场诱导融合电场诱导融合n将二种细胞混合物经过10-100V/cm的低强度非均匀交变电场作用时，细胞之间就会发生紧密接触，形成稳定的串珠状偶极子排列。在此基础上再对细胞实施瞬间高强度电脉冲就会发生膜击穿，不同细胞间通过膜脂质分子重排就能实现融合，形成
26、一个双核或者多核的细胞。n一般来说，击穿电压为0.5-10KV/cm，作用时间为30-50微秒。n电场诱导融合不损伤细胞，具有可人为操作的控制的特性，融合率较高。电融合仪电融合仪（二）完整细胞之间的融合（二）完整细胞之间的融合n取一定数量（107-108个/ml）的二种亲本细胞，充分混合离心，取下层细胞悬液0.1ml逐滴加入0.4ml、37、40%的PEG溶液，37静置90秒缓慢加入5-10ml无血清培养液，摇晃4-5次，离心，除去上清液每0.1ml细胞悬液加入25ml完全培养基，以每孔0.1ml分装于96孔培养板上。37下CO2培养箱中培养。动物细胞融合动物细胞融合动物细胞的融合还动物细胞的
27、融合还常常用到灭活的病常常用到灭活的病毒作为诱导剂毒作为诱导剂 （三）融合后杂种细胞的筛选技术（三）融合后杂种细胞的筛选技术n筛选杂种细胞的目的是为了获得性能优良的杂合细胞。1、杂种细胞的筛选原理杂种细胞的筛选原理2、筛选系统筛选系统1、杂种细胞的筛选原理、杂种细胞的筛选原理n将融合后的细胞混合物于选择性培养基上培养，终止那些同型将融合后的细胞混合物于选择性培养基上培养，终止那些同型多核、异型多核细胞以及未能发生融合的亲本细胞的生长繁殖，多核、异型多核细胞以及未能发生融合的亲本细胞的生长繁殖，而仅仅允许而仅仅允许异型双核细胞异型双核细胞繁殖。繁殖。（1）同型多核融合细胞）同型多核融合细胞-无法
28、合成无法合成DNA，而失去繁殖能力。而失去繁殖能力。（2）异型多核融合细胞）异型多核融合细胞-细胞核不能进行再次分裂，也失去细胞核不能进行再次分裂，也失去繁殖能力。繁殖能力。2、筛选系统、筛选系统（1）HAT选择系统选择系统（2）抗药性选择系统抗药性选择系统（3）营养互补选择系统营养互补选择系统（4）原位杂交法（略）原位杂交法（略）（5）基因探针选择法（略）基因探针选择法（略）（1）HAT选选择择系系统统n正常的动物细胞正常的动物细胞，其，其DNA的合成途径有二条：的合成途径有二条：全合成途径全合成途径-利用外源性营养物合成利用外源性营养物合成DNA。这一途径能被氨基喋呤所阻断。这一途径能被氨
29、基喋呤所阻断。补救合成途径补救合成途径-利用游离嘌呤和嘧啶来合成。利用游离嘌呤和嘧啶来合成。HAT是含有次黄嘌呤（是含有次黄嘌呤（H）+氨基喋呤（氨基喋呤（A）+胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基。）的一种选择性培养基。A、骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞能够在体外长期分裂繁殖，但是骨髓瘤细胞能够在体外长期分裂繁殖，但是其其DNA合成存在着缺陷。合成存在着缺陷。当培养基中含有氨基喋呤（当培养基中含有氨基喋呤（A）时，骨髓瘤细胞就无法正常生长。）时，骨髓瘤细胞就无法正常生长。HPRT-型骨髓瘤细胞型骨髓瘤细胞-属于次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶缺陷型细胞，其嘌呤只能通属于次黄嘌呤鸟嘌
30、呤核苷酸转移酶缺陷型细胞，其嘌呤只能通过全合成途径进行合成。过全合成途径进行合成。TK-型骨髓瘤细胞型骨髓瘤细胞-属于胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型细胞，其嘧啶只能通过全合成途径进属于胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型细胞，其嘧啶只能通过全合成途径进行合成。行合成。B、淋巴细胞淋巴细胞-同时含有合成同时含有合成DNA的二条途径，但是不能够在体外长期分裂繁殖。在人的二条途径，但是不能够在体外长期分裂繁殖。在人工培养基中的存活时间只有工培养基中的存活时间只有1-2天。天。C、骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞+淋巴细胞淋巴细胞=杂交瘤细胞杂交瘤细胞-既能够在体外长期分裂繁殖，又能够通过二条既能够在体外长期分裂繁殖，又能够通过二条途
31、径合成途径合成DNAn因此在带有选择性因此在带有选择性的的HAT培养基中，只有杂交瘤细胞才能正常存活培养基中，只有杂交瘤细胞才能正常存活。（2）抗药性选择系统）抗药性选择系统n利用生物细胞对于药物敏感性的差异程度，来筛选杂种细胞的方法，称为抗药性选择系统。一种亲本细胞M对药物A敏感、同时对药物B不敏感。另一种亲本细胞N对药物A不敏感、而对药物B敏感。M+N融合后的杂合细胞P同时对药物A、B均不敏感。n那么，在同时含有药物A、药物B的选择性培养基中（A）亲本细胞亲本细胞M不能生长不能生长（B）亲本细胞亲本细胞N也不能生长也不能生长（C）只有杂合细胞只有杂合细胞P才能在选择性培养基中存活。才能在选
32、择性培养基中存活。n这样，经过反复分离和继代移植，就可以筛选出杂种细胞。（3）营养互补选择系统）营养互补选择系统n生物细胞在缺乏某种营养成份时就不能生长，这种细胞称为营养缺陷型细胞。A亲本细胞为色氨酸缺陷型。B亲本细胞为苏氨酸缺陷型。A+B融合后的杂合细胞C则为非缺陷型。n在同时不含色氨酸+苏氨酸的选择性培养基中。A、B亲本细胞均不能正常生长亲本细胞均不能正常生长而只有而只有A+B融合后的杂合细胞融合后的杂合细胞C才能存活才能存活动物细胞大规模生产技术动物细胞大规模生产技术n动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下，在在细胞生物反应器细胞生物反应器（bioreactorbioreactor）中，
33、）中，进行大量培养有用的动物细胞，生产药品的技术。n2020世纪世纪60-7060-70年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。技术。n是目前生物高科技药物大规模生产的是目前生物高科技药物大规模生产的核心技术核心技术（一）（一）培养材料培养材料（二）（二）培养基培养基（三）（三）培养方法培养方法（四）（四）动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器（五）（五）操作方式操作方式（六）（六）动物细胞培养国内外生产现状动物细胞培养国内外生产现状（一）动物细胞大规模培养材料n传代细胞系n工程细胞
34、系：采用细胞融合或基因工程技术构建的细胞系（二）培养基（二）培养基1、含小牛血清的培养基、含小牛血清的培养基-在培养基中添加在培养基中添加5-10%的小牛血清。的小牛血清。2、不含小牛血清的培养基、不含小牛血清的培养基-具体有三种类型具体有三种类型（1）基本合成培养基）基本合成培养基（2）基本合成培养基）基本合成培养基+生长因子生长因子（3）基本合成培养基）基本合成培养基+组织抽提物组织抽提物n起血清作用的各类生长因子起血清作用的各类生长因子-铁传递蛋白、乙醇胺、胰岛素、促铁传递蛋白、乙醇胺、胰岛素、促胃酸激素、维生素胃酸激素、维生素C、可的松、硒等等成份可的松、硒等等成份。（二）培养方法（二
35、）培养方法1、细胞悬浮培养法细胞悬浮培养法：CHOCHO细胞细胞(中华仓鼠卵巢中华仓鼠卵巢)、BHK-21BHK-21细胞细胞(仓鼠仓鼠肾肾)，杂交瘤细胞，昆虫细胞等进行悬浮培养，杂交瘤细胞，昆虫细胞等进行悬浮培养2、滚瓶培养法滚瓶培养法3、微载体培养法微载体培养法：(贴壁贴壁-悬浮培养悬浮培养)4、固定化培养法固定化培养法：人二倍体细胞、人二倍体细胞、传代细胞传代细胞VeroVero细胞细胞(非洲绿猴非洲绿猴肾肾)等利用载体进行贴壁培养等利用载体进行贴壁培养1、细胞悬浮培养法、细胞悬浮培养法（1）细胞悬浮培养法的）细胞悬浮培养法的概念概念（2）细胞悬浮培养法的细胞悬浮培养法的工艺流程工艺流程
36、（3）细胞悬浮培养法的）细胞悬浮培养法的注意事项注意事项（1）细胞悬浮培养法的概念）细胞悬浮培养法的概念n是细胞在培养液中呈现悬浮生长繁殖的方法称为细胞悬浮培养法，是细菌发酵，是细菌发酵基础上改进的基础上改进的主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等,也适用于兼性贴壁细胞也适用于兼性贴壁细胞气升式，搅拌式反应器气升式，搅拌式反应器细胞悬浮培养法的操作方式有3种：分批法、半连续法、连续法。n细胞悬浮培养法适用于培养确立细胞株、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液细胞和淋巴细胞。可用来大量生产疫苗、a-干扰素、白介素、淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体（McAb）。（2
37、）细胞悬浮培养法的工艺流程细胞悬浮培养法的工艺流程n由配料罐培养液贮罐平衡罐前培养罐主培养罐培养液分离槽离心提取干燥设备所组成。n在配料罐内配制培养液，经过无菌过滤之后，送入培养液贮罐送入平衡罐，调整氧化还原电位至70-100Mv，以提高细胞生长繁殖速度送入前培养罐进行细胞增殖培养，再送入主培养罐生产和合成药物培养后的细胞悬液送入收集罐和分离槽离心提取干燥设备（3）细胞悬浮培养法的注意事项）细胞悬浮培养法的注意事项A、在培养过程中，为了保证细胞处于单颗粒均匀悬浮状态，需要采用搅拌式反应器或者气升式反应器，以较低的搅拌速度，并以一定速度通入含水量5%CO2的无菌空气，来保证细胞处于悬浮状态，并维
38、持培养液中一定的溶解氧。B、为了使细胞不至于产生凝聚、成团或者沉淀，在培养基的基础盐溶液中不加Ca和Mg。同时间歇式或者连续地更换部份培养液。C、在进行动物细胞培养过程中，随时检测和控制培养过程的温度、压力、溶解氧、CO2、PH值、氧化还原电位、搅拌速度、通气量、营养成份。D、细胞密度：n在动物组织中的细胞密度为109个/ml，为自然界中的最高密度状态。n体外悬浮细胞培养状态，细胞密度一般控制在5*106个/ml。n在新颖的灌流培养系统中，细胞密度可达到107个/ml。4、固定化培养法、固定化培养法（1）固定化培养法的）固定化培养法的定义定义（2）动物细胞的固定化培养）动物细胞的固定化培养方法
39、方法（3）目前已经开发的固定化培养）目前已经开发的固定化培养装置装置（4）中空纤维培养器中空纤维培养器（1）固定化培养法的定义）固定化培养法的定义n又称大载体培养，指采用高分子材料将细胞限制或者定位于特定的空间位置，制成固定化颗粒，进而在培养液中培养的技术称为细胞固定化培养法细胞固定化培养法。n固定化培养有优点有：A、细胞可维持在较小体积的培养液中生长。B、对细胞抗剪切力和污染力强。C、易于更换培养液。D、细胞和培养液容易分离，分离纯化简单。E、细胞生长密度高，培养液中产物浓度高。（2）动物细胞的固定化培养方法）动物细胞的固定化培养方法n吸附法-所用载体有陶瓷颗粒、玻璃珠、硅胶颗粒、中空纤维膜
40、、中空纤维培养器。n包埋法-将细胞包埋于海藻酸钠、海藻酸钙、琼脂、琼脂糖、胶原、血纤维等海绵状基质之中。n微囊法-将细胞好的细胞，再用长链氨基酸聚合物包被形成半通透性外被膜。（3）目前已经开发的固定化培养装置）目前已经开发的固定化培养装置1、多层平板式反应器2、多层园盘式反应器3、螺旋转膜式反应器4、多层托盘式反应器5、卷带式反应器6、中空纤维筒式反应器（下面以此作为主要讲解内容）7、流化床式反应器8、微载体搅拌式悬浮培养反应器9、笼式通气搅拌反应器10、贴壁培养反应器11、蜂窝状反应器培养筒内由数千根中空纤维所组成，封存在培养筒内由数千根中空纤维所组成，封存在特制的圆筒里。圆筒内形成特制的圆
41、筒里。圆筒内形成2 2个空间：每根个空间：每根纤维的管内为纤维的管内为“内室内室”，灌流无血清培养液，灌流无血清培养液供细胞生长供细胞生长,管与管之间的间隙为管与管之间的间隙为“外室外室”。接种的细胞贴附接种的细胞贴附“外室外室”管壁上，并吸取管壁上，并吸取从从“内室内室”渗透出来的养分生长繁殖。渗透出来的养分生长繁殖。培养液中的血清也输入到培养液中的血清也输入到外室外室，由于血清，由于血清和细胞分泌产物如单抗的分子质量大而无法和细胞分泌产物如单抗的分子质量大而无法穿透到穿透到内室内室去，只能留在去，只能留在外室外室并且不断并且不断被浓缩。被浓缩。（4）中空纤维培养器）中空纤维培养器当需要收集
42、这些产物时，只要把管与管之间当需要收集这些产物时，只要把管与管之间的的“外室外室”总出口打开，产物就能流出来。总出口打开，产物就能流出来。细胞生长繁殖过程中的代谢废物，因为都属细胞生长繁殖过程中的代谢废物，因为都属小分子物质，可以从管壁渗进小分子物质，可以从管壁渗进“内室内室”,最后最后从从“内室内室”总出口排出总出口排出,不会对不会对“外室外室”细胞细胞产生毒害作用。产生毒害作用。一般细胞在接种一般细胞在接种13周后，就可以完全充满周后，就可以完全充满管壁的空隙。细胞厚度最终可达管壁的空隙。细胞厚度最终可达10层之多。层之多。细胞停止增殖后，仍可以维持其高水平代谢细胞停止增殖后，仍可以维持其
43、高水平代谢和分泌功能，长达几个星期甚至几个月和分泌功能，长达几个星期甚至几个月。中空纤维培养法中空纤维培养法模拟体内的模拟体内的三维培养状态三维培养状态，细胞接种在中空纤维的外细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟人腔，利用中空纤维模拟人工毛细血管供给营养，使工毛细血管供给营养，使细胞高密度生长细胞高密度生长材料有硅胶，聚砜，聚丙材料有硅胶，聚砜，聚丙烯等，为烯等，为半透膜半透膜优点优点n细胞生长密度高，可达细胞生长密度高，可达108个个/ml以上。以上。n细胞处于接近生理状态的理化梯度之中。细胞处于接近生理状态的理化梯度之中。n营养物质可以有效地分布，代谢产物能够及时排出。营养物质可以有
44、效地分布，代谢产物能够及时排出。n细胞培养可达数月，易于实现连续培养。细胞培养可达数月，易于实现连续培养。n细胞分泌的蛋白质浓度高，产品纯度可高达细胞分泌的蛋白质浓度高，产品纯度可高达60-90%。n反应器体积较小。反应器体积较小。n可培养多种细胞，有利于降低成本可培养多种细胞，有利于降低成本。2、滚瓶培养n适用于贴壁依赖型细胞和兼性贴壁细胞。n放大容易，也能实现灌流培养。n操作繁琐，传代或放大时需要用蛋白酶将细胞从瓶壁上消化下来。2、微载体培养法微载体培养法（1）定义）定义-将细胞吸附于微载体表面，再在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面生长成单层的方法称为微载体培养法。（2）微载体培养
45、法的优点）微载体培养法的优点:兼有贴壁培养和悬浮细胞培养的双重特点。在不增加培养罐体积的条件下就能增加动物细胞产量。60-250um60-250um的颗粒，的颗粒，创造大面积供细胞贴附生长创造大面积供细胞贴附生长载体体积小，比重轻，在载体体积小，比重轻，在轻度搅拌下即可携带细胞悬浮轻度搅拌下即可携带细胞悬浮于培养基于培养基2020世纪世纪8080年代正式用于工业化生产各种疫苗和细胞产品年代正式用于工业化生产各种疫苗和细胞产品（3）微载体培养法所用的材料）微载体培养法所用的材料n对细胞无毒；容易使细胞产生贴附；其密度大于1；溶胀后微粒的直径为200-300um，可容纳几百个细胞；耐高温；非刚性，
46、避免相互碰撞对细胞损伤；不吸附培养基中营养成分；多次使用。n目前已经选用的材料有：DEAE-Sephadex-A50DEAE-Sephadex-A52QAE-Sephadex 经处理的塑料 尼龙二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺 聚苯乙烯n市场上出售的商品微粒有：DEAE-交联葡聚糖（Cytodex-1，Superbeads）二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺（Biocarrier）聚苯乙烯（Biosilon）商业化微载体 商品名商品名 基质基质 带电基和带电基和 形状形状 直径大小直径大小 比表面积比表面积 密度密度 透明性透明性 交换当量交换当量 meq/g /um /(cm3.g-1)(g.ml-1)Cyt
47、odex1 葡聚糖葡聚糖 DEAE1.5 球状球状 131210 6000 1.03 +Superbeads 葡聚糖葡聚糖 DEAE2.0 球状球状 136205 5000 6000 ND +Biocarrier 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 二甲胺丙基二甲胺丙基1.4 球状球状 120180 5000 1.04 +Cytodex2 葡聚糖葡聚糖 三甲基三甲基-2-羟氨基丙基羟氨基丙基 球状球状 114198 5500 1.04 +Cytodex3 葡聚糖葡聚糖 60ug胶原胶原/cm2 球状球状 133215 4500 1.04 +Ventragel 交联明胶交联明胶 明胶明胶 球状球状 15025
48、0 ND ND +Celibeads 交联明胶交联明胶 明胶明胶 球状球状 115235 33004300 1.03 1.04+Biosilon 聚苯乙烯聚苯乙烯 负电荷负电荷 球状球状 160300 225 1.05 Cytosperes 聚苯乙烯聚苯乙烯 负电荷负电荷 球状球状 160300 250 1.04 DE-53 纤维素纤维素 DEAE2.0 柱状柱状 4050 ND ND -（4）Cytodex-1微载体培养法的技术指标微载体培养法的技术指标n干颗粒直径60-87um、在培养液中可膨胀成160-230um，每克微粒的表面积为0.6平方米，相当于7个标准转瓶（直径285mm*长度1
49、10mm）、采用培养罐进行培养。nCytodex-1的浓度为1mg/ml。相当于8000-9000粒/ml。其表面积为10cm2。细胞生长密度可达105个/ml。n培养前24小时，将细胞贴附于载体上。培养液、葡萄糖、细胞同时加入培养罐中。温度为37PH=7.2-7.3溶解氧为20%搅拌速度为60-75转/分钟。（三）动物细胞生物反应器实验室规模：小于实验室规模：小于20L20L的反应器，培的反应器，培养工艺研究养工艺研究中试规模：中试规模：20-100L20-100L的反应器，提供的反应器，提供一定量的产品，共纯化、临床前的一定量的产品，共纯化、临床前的各种检测和临床观察，工艺优化实各种检测和
50、临床观察，工艺优化实验等的需要验等的需要生产规模：大于生产规模：大于100L100L，1000L1000L居多，居多，最大达最大达8000L8000L，用于生产，提供产品，用于生产，提供产品85 搅拌式生物反应器最经典最经典、最早用于动物、最早用于动物细胞培养的反应器细胞培养的反应器通气好，搅拌剪切力小，通气好，搅拌剪切力小，有利于长时间，高密度有利于长时间，高密度培养培养主要主要用于悬浮细胞用于悬浮细胞的培的培养、微载体培养、微囊养、微载体培养、微囊培养以及结团培养培养以及结团培养最早于最早于19841984年由英国科学家年由英国科学家SpierSpier发明。发明。该装置的主要特点是可以避