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1、第四章第四章细胞规模化培养技术细胞规模化培养技术细细 胞胞 工工 程程电电 子子 课课件件华华中中农农业业大大学学生生命命科科学学技技术术学学院院概述概述生物反应器的类型与特点生物反应器的类型与特点细胞规模化培养的主要技术环节细胞规模化培养的主要技术环节规模化培养中常见的问题与解决途径规模化培养中常见的问题与解决途径主要内容主要内容4.1 概述概述细胞规模化培养在现代工业中的潜力细胞规模化培养在现代工业中的潜力高等生物细胞规模化培养现状高等生物细胞规模化培养现状细胞规模化培养在现代工业中的潜力细胞规模化培养在现代工业中的潜力在在植植物物生生物物技技术术中中，应应用用培培养养细细胞胞系系统统合合
2、成成有有用用的的天天然然产产物物，很很可可能能发发展展成成为为一一个个广广义义的的化化学学工工业业的的一一个个组组成成部部分分。长长期期以以来来，植植物物一一直直是是许许多多化化学学品品的的主主要要资资源源，特特别别在在制制药药和和食食品品加加工工业业中中更更是是不不可可缺缺少少。据据不不完完全全统统计计，至至少少有有2020左左右右的的药药物物是是由由植植物物衍衍生生而而来来的的，而而且且每每年年都都可可发发现现许许多多植植物物来来源源的新化合物。的新化合物。植植物物次次生生代代谢谢产产物物在在医医药药、食食品品、轻轻化化工工业业等等领域具有重要意义。领域具有重要意义。李李时时珍珍（1593
3、1593）在在本本草草纲纲目目中中所所开开列列的的18921892种种药药物物绝绝大大多多数数是是植植物物药药物物，目目前前仍仍有有约约2525的的法法定定药药品品来来自自植植物物。其其药药物物的的有有效效成成分分均均为为次次生生产物。产物。许许多多植植物物次次生生代代谢谢产产物物是是优优良良的的食食品品添添加加剂剂和和名名贵贵化化妆妆品品原原料料。有有些些是是生生物物毒毒素素的的主主要要来来源源，可可以以用用于于杀杀虫虫、杀杀菌菌，而而对对环环境境和和人人畜畜无无害害，是是理理想想的环保产品。的环保产品。IndustryProductPlant speciesUsePharmaceutica
4、lsAjmalicineCatharanthus roseusCirculatory problemsBerberineCoptis japonicaAntimicrobialQuinineCinchona ledgerianaAntimalarialCamptothecinCamptotheca acuminataAntitumorDigoxinDigitalis lanataCardiatonicProductsSynthesizedUsingCellCulture （引自（引自Ramawat和和Merillon，1999）IndustryProductPlant speciesUseFo
5、odAnthocyaninsDaucus carota PigmentQuinineCinchona ledgerianaBittering agentSpearmintMenthaFlavorAgriculture PyrethrinChrysanthemumInsecticideCosmeticsJasmineJasminumPerfumeProductsSynthesizedUsingCellCulture（引自（引自Ramawat和和Merillon，1999）规规模模化化细细胞胞培培养养是是生生产产植植物物次次生生产产物物的的理想途径。理想途径。保护生态环境保护生态环境 提高生产效率
6、提高生产效率发展新型生物技术产业发展新型生物技术产业生产方式生产方式生产周期生产周期紫草宁含量紫草宁含量（干重）（干重）完整植株完整植株2 23 3年年1 12 2植物细胞培养植物细胞培养3 3周周1414来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较（引自熊宗（引自熊宗贵，1999）Examplesofenhancementinnaturalproductyieldinselectedcelllinescomparewithparentplantmaterial.(AfterFowler,1983)Chemical product plantCell yield
7、(%DW)Whole plant yield(%DW)Ratio cell yield/whole plant Glutathione N.tabacum 1.00.110Nicotine N.tabacum5.02.12AnthraquinonesM.citrifolia18.02.28Rosmarinic acidC.blumei27.03.09AjmalicineC.roseus2.20.37SErpentineC.roseus1.80.53DiosgeninD.deltoidea3.52.0270年年代代后后期期，基基因因工工程程使使得得外外源源基基因因成成功功地地在在微微生生物物中中
8、得得以以表表达达，由由于于其其简简单单快快速速、生生产产效效率率高高，逐逐渐渐形形成成了了以以原原核核细细胞胞为为培培养养对对象象的的基基因因工工程程技技术术和和大大规规模模微微生生物物培培养养技技术术，一一度度大大有有取取代代动动物物细细胞胞培培养这势。养这势。但但许许多多生生物物活活性性蛋蛋白白不不能能在在微微生生物物工工程程菌菌细细胞胞中中表表达达，而而只只能能在在动动物物细细胞胞中中产产生生。也也不不能能将将蛋蛋白白质质产产物自动分泌到细胞外，给产物分离带来麻烦。物自动分泌到细胞外，给产物分离带来麻烦。80年年代代后后，随随着着基基因因工工程程技技术术和和细细胞胞融融合合技技术术的的迅
9、迅速速发发展展，已已经经能能够够把把特特定定的的外外源源基基因因通通过过PCR技技术术扩扩增增几几千千倍倍，并并可可转转染染到到动动物物细细胞胞内内，使使其其高效表达。高效表达。动动物物细细胞胞培培养养生生产产的的各各种种产产品品是是其其他他植植物物、微微生生物物细细胞胞培培养养所所无无法法比比拟拟的的，在在人人类类生生活活特特别别是是医医学中发挥越来越大的作用。学中发挥越来越大的作用。4.1.2 高等生物细胞规模化培养现状高等生物细胞规模化培养现状1956年年，Nichell和和 Routin提提出出了了植植物物细细胞胞培培养养生产化合物的第一个专利申请。生产化合物的第一个专利申请。20世世
10、纪纪60年年代代以以来来，组组织织培培养养的的迅迅速速发发展展为为细细胞胞培培养养奠奠定定了了技技术术基基础础。各各种种细细胞胞培培养养基基的的设设计计、植植物物细细胞胞生生物物反反应应器器的的研研制制、植植物物细细胞胞培培养养动动力力学学研研究究、植植物物细细胞胞培培养养生生产产次次级级代代谢谢物物的的调调节节控控制理论与应用等方面的研究都取得了显著进展。制理论与应用等方面的研究都取得了显著进展。1979年年，国国际际组组织织培培养养协协会会专专业业术术语语委委员员会会建建议议将将组组织织培培养养和和细细胞胞培培养养的的概概念念加加以以区区分分。以以此此为为契契机机，20世世纪纪80年年代代
11、以以来来植植物物细细胞胞培培养养进进入入了了高高速发展阶段。速发展阶段。愈伤组织培养既属于组织培养又属于细胞培养。愈伤组织培养既属于组织培养又属于细胞培养。1983年年，日日本本三三井井石石油油化化学学工工业业公公司司再再世世界界上上首首次成功的采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁。次成功的采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁。此此后后，人人参参细细胞胞培培养养生生产产人人参参皂皂苷苷，黄黄连连细细胞胞培培养养生生产产小小檗檗碱碱，长长春春花花细细胞胞培培养养生生产产长长春春花花碱碱，红红豆豆杉杉细细胞胞培培养养生生产产紫紫杉杉醇醇等等相相继继取取得得成成功功，迄迄今今为为止止，已已经经从从400多多
12、种种植植物物中中分分理理出出细细胞胞，并并通过细胞培养，获得通过细胞培养，获得600多种化合物。多种化合物。植物细胞大规模培养的技术要求：植物细胞大规模培养的技术要求：从从工工程程的的角角度度讲讲必必须须要要进进一一步步研研究究和和开开发发适适宜宜于于植植物物细细胞胞生生长长和和生生产产的的生生物物反反应应器器，建建立立最最佳佳的的控制和调节系统；控制和调节系统；从从培培养养技技术术方方面面讲讲必必须须满满足足以以下下三三个个条条件件：培培养养的的细细胞胞在在遗遗传传上上应应是是稳稳定定的的，以以得得到到产产量量恒恒定定的的产产物物；细细胞胞生生长长及及生生物物合合成成的的速速度度快快，在在较
13、较短短的的时时间间内内能能得得到到较较高高产产量量的的终终产产物物；代代谢谢产产物物要要在在细细胞胞中中积积累累而而不不被被迅迅速速分分解解，最最好好能能将将其其释释放放到到培养基中。培养基中。表动物细胞培养的产物表动物细胞培养的产物类类 型型产产 物物人疫苗人疫苗小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗源、疱症、某些癌症源、疱症、某些癌症动物疫苗动物疫苗口蹄疫、鸡痘病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、口蹄疫、鸡痘病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草鱼出血病、犬瘟病犬瘟、草鱼出血病、犬瘟病酶酶 尿激酶、细胞色素尿激酶、细胞色素P450P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶
14、、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧纤维蛋白溶酶原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶酶激素激素 促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒膜促性促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒膜促性腺激素、促黄体激素、促滤泡激素、生长激素腺激素、促黄体激素、促滤泡激素、生长激素免疫调节因子免疫调节因子白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、干扰素、血清胸腺因子、巨噬细胞细胞介素、干扰素、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、毒力因子、-细胞生长因子细胞生长因子一、植物细胞规模化培养过程的特点及对反应器一、植物细胞规模化培养过程的特点及对反应器 的要求的
15、要求 v与微生物细胞的差别与微生物细胞的差别v抗剪切能力弱抗剪切能力弱v有聚集成团的趋势有聚集成团的趋势 v好气性好气性 v操作周期较长操作周期较长 4.2 生物反应器的类型与特点生物反应器的类型与特点总总体体上上讲讲，适适合合植植物物细细胞胞培培养养的的反反应应器器应应该该具具有有适适宜宜的的氧氧传传递递、良良好好的的流流动动性性和和较较低低的的剪剪切切力力，根根据不同植物细胞生长和代谢产物积累特点。据不同植物细胞生长和代谢产物积累特点。二、植物细胞反应器的类型与特点二、植物细胞反应器的类型与特点植物细胞培养生物反应器植物细胞培养生物反应器*反反应器器类型型体体积（L）培养植物种培养植物种类
16、搅拌式拌式7，15D.carota胡胡萝卜卜搅拌式拌式20，15500N.tabacum烟草烟草搅拌式拌式5000C.roseus长春花春花螺旋螺旋搅拌式拌式20C.blumei五彩五彩苏提升提升搅拌式拌式2.5P.elliotii爱氏氏马先蒿先蒿膜通气膜通气搅拌式拌式20T.rugosum毛莨毛莨鼓泡式鼓泡式20，30，130Ginkgo人参人参鼓泡式鼓泡式65，1500N.tabacum烟草烟草倾斜鼓泡式斜鼓泡式1，10E.californica花菱草花菱草外外环气升式气升式10，30，85C.roseus长春花春花导筒气升式筒气升式20，210D.lanata狭叶毛地黄狭叶毛地黄转鼓式鼓
17、式1-4V.rosea长春花春花*引自黄艳等，2001。（一）机械搅拌式反应器（一）机械搅拌式反应器图图4-1 4-1 标准搅拌式生物反应器标准搅拌式生物反应器结构示意图结构示意图图图4-2 4-2 搅拌桨的类型搅拌桨的类型 （1）搅拌桨型式的改进：）搅拌桨型式的改进：一一般般认认为为，涡涡轮轮状状叶叶轮轮优优于于平平叶叶轮轮，而而平平叶叶轮轮又又优优于于螺螺旋旋状状叶叶轮轮。因因此此采采用用适适宜宜的的搅搅拌拌桨桨类类型型和和结结构构可可使使植植物物细细胞胞的的生生长长不不受受损损害害，最最常常用用的是标准的是标准RushtonRushton涡轮机。涡轮机。在在高高粘粘度度培培养养基基中中，
18、需需要要使使用用其其他他类类型型直直径径较较大大的的叶叶轮轮，如如大大的的搅搅拌拌桨及螺旋式叶轮。桨及螺旋式叶轮。法法国国InceltechInceltech公公司司成成功功地地研研制制了了带带有有倾倾斜斜刀刀片片的的涡涡轮轮，该该结结构构提提供供了了混合的轴向流和辐射流。混合的轴向流和辐射流。KamanKaman等等设设计计了了带带有有一一个个双双螺螺旋旋带带状状叶叶轮轮和和三三个个表表面面挡挡板板的的搅搅拌拌罐罐，实实验验证证明明其其适适合合于于剪剪切切力力敏敏感感的细胞高密度培养。的细胞高密度培养。钟钟建建江江等等通通过过培培养养紫紫苏苏细细胞胞进进行行比比较较，发发现现带带以以微微孔孔
19、金金属属丝丝网网作作为为空空气气分分布布器器的的三三叶叶螺螺旋旋桨桨反反应应器器 (MRP)(MRP)能能提提供供较较小小的的剪剪切切力力和和良良好好的的供供氧氧及及混混合合状状态态，优优于于六六平平叶叶涡涡轮轮桨桨反反应应器器，并并认认为为在在高高浓浓度度细细胞胞培培养养时时，MRPMRP型型反反应应器器将将显显示示更更大大的的优优越越性。性。（2）搅拌方式也会对剪切剪切作用产生影响）搅拌方式也会对剪切剪切作用产生影响 HvoslefHvoslefEideEide等等利利用用螺螺旋旋形形搅搅拌拌式式生生物物反反应应器器对对挪挪威威云云杉杉(Picea Picea abiesabies)和和桦
20、桦树树(Betula Betula pendulapendula)的的体体胚胚进进行行大大量量繁繁殖殖，发发现现在在较较低低的的搅搅拌拌速速度度下下变变换换搅搅拌拌的的方方向向可可以以降降低低剪剪切切力力，搅搅拌拌器器的的搅搅拌拌方方向向每每10s10s变变换换1 1次次时时，30rpm30rpm的的搅搅拌拌速速度度就可以有较好的混合性能。就可以有较好的混合性能。（二）非机械搅拌式反应器（二）非机械搅拌式反应器 图图4-34-3鼓泡式反鼓泡式反应应器器结结构示意构示意图图、鼓泡式与气升式反应器、鼓泡式与气升式反应器 鼓泡式反应器通过反应鼓泡式反应器通过反应器底部的器底部的喷嘴喷嘴及及多孔板多孔
21、板实现实现气体分散，促进液体流动。气体分散，促进液体流动。这种方式所提供的搅拌力要这种方式所提供的搅拌力要比搅拌式生物反应器柔和得比搅拌式生物反应器柔和得多，于是混合可以在很低的多，于是混合可以在很低的剪切力条件下实现。但鼓泡剪切力条件下实现。但鼓泡式反应器对氧的利用率较低。式反应器对氧的利用率较低。2、气升式反应器、气升式反应器 气升式反应器通过在鼓气升式反应器通过在鼓泡式反应器内部增加一个泡式反应器内部增加一个通气通气管管而提高混合效率。气体在通而提高混合效率。气体在通气管气管轴部轴部喷射，依靠这种方式喷射，依靠这种方式传递动量和能量，通过上升液传递动量和能量，通过上升液体和下降液体的静压
22、差实现气体和下降液体的静压差实现气流循环，以保证良好的传热和流循环，以保证良好的传热和传质传质,并且不出现死角并且不出现死角,流动形流动形式比鼓泡式更均一。式比鼓泡式更均一。图图4-44-4气升式反气升式反应应器器结结构示意构示意图图3、转鼓式反应器、转鼓式反应器 转转鼓鼓式式生生物物反反应应器器是是一一种种新新型型的的反反应应器器,它它是是利利用用转转子子的的转转动动促促进进液液体体中中溶溶氧氧与与营营养养物物的的混混合合。通通过过应应用用不不同同反反应应器器对对烟烟草草细细胞胞悬悬浮浮培培养养的的研研究究发发现现，相相同同条条件件下下转转鼓鼓式式反反应应器器中中细细胞胞生生长长速速率率高高
23、，其其氧氧的的传传递及细胞所受剪切损伤均优于气升式反应器。递及细胞所受剪切损伤均优于气升式反应器。图图4-5转鼓式反应器结构示意图转鼓式反应器结构示意图 可可以以较较容容易易地地控控制制培培养养系系统统的的理理化化环环境境，从从而而可可以以研研究究特特定定的的代代谢谢途途径，并便于调节；径，并便于调节；细细胞胞位位置置的的固固定定使使其其所所处处的的环环境境类类似似于于在在植植物物体体中中所所处处的的状状态态，相相互互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；由由于于细细胞胞固固定定在在支支持持物物上上，培培养养基基可可
24、以以不不断断更更换换，可可以以从从培培养养基基中中提提取取产产物物，免免除除了了培培养养基基中中因因含含有有过过多多的的初初生生产产物物对对细细胞胞代代谢谢的的反反馈馈抑抑制制，也也由由于于细细胞胞留留在在反反应应器器中中，新新的的培培养养基基可可以以再再次次利利用用这这些些细细胞胞生生产产初初生生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；正正是是由由于于细细胞胞固固定定在在一一定定的的介介质质中中，并并可可以以从从培培养养基基中中不不断断提提取取产产物，因此，它可以进行连续生产。物，因此，它可以进行连续生产。(三）三）固定化反应器固定化反应器细细
25、胞胞固固定定化化培培养养技技术术按按照照其其支支持持物物不不同同可可以以分分为两大类：为两大类：a a、包包埋埋式式固固定定化化培培养养系系统统：支支持持物物多多采采用用琼琼脂脂、琼脂糖、藻酸盐聚丙烯酰胺等；琼脂糖、藻酸盐聚丙烯酰胺等；b b、附附着着式式固固定定化化培培养养系系统统：支支持持物物采采用用尼尼龙龙网网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。图图4-6 4-6 固定化系统示意图固定化系统示意图a a：固定床反应器；：固定床反应器；b:b:流化床流化床c c：膜反应器：膜反应器abcd图图4-8不同膜反应器的结构示意图不同膜反应器的结构示意图a：单膜式平板膜反应器
26、；：单膜式平板膜反应器；b：双膜式平板膜反应器；：双膜式平板膜反应器；c：多膜式平板膜反应器；：多膜式平板膜反应器；d：管式膜反应器：管式膜反应器 三、植物细胞反应器系统的设计与控制三、植物细胞反应器系统的设计与控制氧气的运输速率（OTR）由以下方程式给出：式中，液相运输系数（）；a总界面面积（）；溶解氧的理论饱和浓度（）；任何情况下液相中实际测量的溶解氧浓度（）。（一）氧气供应（一）氧气供应图图4-9 氧气的运输过程及反应器中运输的界限氧气的运输过程及反应器中运输的界限（二）光照系统的增设（二）光照系统的增设考虑：光源的安装、光的传递、反应器供气混合考虑：光源的安装、光的传递、反应器供气混合
27、的影响等。的影响等。小规模实验：可采用外部光照的方法小规模实验：可采用外部光照的方法大规模生产：着手研究内部光源反应器。大规模生产：着手研究内部光源反应器。（三）培养控制（三）培养控制 四、动物细胞规模化培养生物反应器四、动物细胞规模化培养生物反应器（一）经典的动物细胞培养反应器（一）经典的动物细胞培养反应器、搅拌式生物反应器、搅拌式生物反应器(Stirred tank bioreactor)(Stirred tank bioreactor)2 2、气升式反应器、气升式反应器(Air-lift bioreactor)(Air-lift bioreactor)4 4、填充床反应器、填充床反应器(
28、Packed bed bioreactor)(Packed bed bioreactor)3 3、流化床反应器（、流化床反应器（Fluidized bed reactorFluidized bed reactor）、中空纤维反应器、中空纤维反应器(Hollow fiber bioreactor)(Hollow fiber bioreactor)供氧方式的改进供氧方式的改进、搅拌式生物反应器、搅拌式生物反应器(Stirred tank bioreactor)(Stirred tank bioreactor)图图4-104-10SpierSpier设计的笼式通气装置设计的笼式通气装置图图4-114
29、-11CelliGenCelliGen笼式通气搅拌器笼式通气搅拌器图图4-12CelliGen细胞培养罐细胞培养罐图图4-13 CellCul-504-13 CellCul-50细胞培养反应器细胞培养反应器搅拌桨的改进搅拌桨的改进 反应器中的搅拌桨主要有两种类型：一种是反应器中的搅拌桨主要有两种类型：一种是放放射向流叶轮射向流叶轮，一种是，一种是轴向流叶轮轴向流叶轮。在动物细胞培养中宜采用轴向流搅拌桨，使流在动物细胞培养中宜采用轴向流搅拌桨，使流体流动的方向平行于轴向。体流动的方向平行于轴向。图图4-12两种搅拌桨的形状两种搅拌桨的形状图图4-15两种搅拌桨产生的流动情形两种搅拌桨产生的流动情
30、形19791979年，年，KatingerKatinger等人首次应用等人首次应用气生式生物反应器进行动物细胞气生式生物反应器进行动物细胞悬浮培养。悬浮培养。英国英国CelltechCelltech公司是应用气升式公司是应用气升式生物反应器进行动物细胞大规模生物反应器进行动物细胞大规模培养的成功范例。培养的成功范例。19851985年应用年应用100L100L规模的气升式生物规模的气升式生物反应器大规模培养杂交瘤细胞反应器大规模培养杂交瘤细胞;目前已开发出目前已开发出10000L10000L规模的气升式规模的气升式生物反应器用于各类单抗的大量生生物反应器用于各类单抗的大量生产。产。2 2、气升
31、式反应器、气升式反应器(Air-lift bioreactor)(Air-lift bioreactor)图图4-16气升式反应器类型气升式反应器类型(a)内内循循环环式式；(b)外外循循环环式式3 3、流化床反应器（、流化床反应器（Fluidized bed reactorFluidized bed reactor）图图4-17流化床结构示意图流化床结构示意图4 4、填充床反应器、填充床反应器(Packed bed bioreactor)(Packed bed bioreactor)图图4-18CelliGenPlus填充床反应器填充床反应器、中空纤维反应器、中空纤维反应器(hollow f
32、iber bioreactor)(hollow fiber bioreactor)图图4-19中空纤维管扫描图片及其反应器示意图中空纤维管扫描图片及其反应器示意图实验室规模反应器实验室规模反应器工业规模反应器100 L 500,000 L Process control and monitoringProcess parameters to be monitorsSugarconsumptionpHTemperatureFermentationtime(h)AgitationCellDryWeightProductComputersoftwareshavebeendevelopedtomoni
33、torandchangetheprocessonline（二）新型动物细胞培养反应器（二）新型动物细胞培养反应器图图4-20CellCube贴壁细胞培养系统贴壁细胞培养系统CellCube细胞方块细胞方块 图图4-214-21摇袋式细胞培养生物反应器工作示意摇袋式细胞培养生物反应器工作示意图图 旋转式细胞培养系统旋转式细胞培养系统(the rotary cell culture syetem，RCCS)摇袋式细胞培养生物反应器摇袋式细胞培养生物反应器(Wave Bioreactor)(三三)反应器培养中的关键问题及解决途径反应器培养中的关键问题及解决途径 搅拌桨设计搅拌桨设计加设导流筒加设导流
34、筒减小气泡尺寸减小气泡尺寸供氧方式的改变供氧方式的改变4.3 细胞规模化培养的主要技术环节细胞规模化培养的主要技术环节种子细胞的繁殖与培养系统的建立种子细胞的繁殖与培养系统的建立细胞规模化培养与调控细胞规模化培养与调控目的产物的分离与纯化目的产物的分离与纯化4.3.1 种子细胞的繁殖与培养系统的建立种子细胞的繁殖与培养系统的建立种子细胞选择外植体外植体选择高高产细胞胞选择植植物物类类型型：植植物物细细胞胞的的遗遗传传基基础础是是天天然然产产物物生生产产的的基基本本影影响响因因素素，不不同同植植物物产产生生的的天天然然产产物物种种类类之之所所以以不不同同，从从根根本本上上来来说说是是因因为为它它
35、们们具具有有不不同同的的遗遗传传基基础础。在在确确定定生生产产某某一一种种化化合合物物以以后后，首首先先必必须须准准确确选选择择那那些些能能够够产产生生目目的的化化合合物物的的植植物种类及其品种或单株。物种类及其品种或单株。组组织织器器官官：由由于于天天然然产产物物一一般般为为次次生生代代谢谢产产物物，而而植植物物次次生生代代谢谢产产物物的的积积累累具具有有组组织织器器官官特特异异性性，因因此此，在在起起始始细细胞胞培培养养时时应应尽尽量量选选择择自自然然状状态态下下产生天然产物的器官、组织为外植体。产生天然产物的器官、组织为外植体。部分代表性植物次生产物及其植物资源部分代表性植物次生产物及其
36、植物资源*工工业用途用途次生次生产物物植物植物资源源医医药可待因（植物碱）可待因（植物碱）Papaversomniferm薯薯蓣皂苷配基皂苷配基Dioscoreadeltoidea奎宁奎宁Cinchonaledgeriana地地高高辛辛（异异羟基基洋洋地地黄黄毒毒苷苷原）原）Digitalislanata莨菪胺莨菪胺Daturastrathus长春花碱春花碱Catharanthusroseus农业化学化学除虫菊除虫菊酯Chrysanthemumcinerariaefolium食品，食品，饮料料ThanmatinThanumatococcusdanielli化化妆品品茉莉油茉莉油Jasmimum
37、spp.（引自（引自RamawatRamawat和和MerillonMerillon，1999 1999）有效成分分析有效成分分析悬浮浮细胞系胞系单细胞克隆胞克隆种种细胞增殖胞增殖 在在大大多多数数情情况况下下，来来自自起起始始材材料料的的细细胞胞系系通通常常是是一一个个异异质质细细胞胞群群体体，细细胞胞间间在在次次生生产产物物积积累累能力上有很大差异。能力上有很大差异。为为了了提提高高筛筛选选效效率率，还还可可根根据据后后续续的的培培养养条条件件适适当当增增加加选选择择压压力力，也也可可采采用用一一些些突突变变的的方方法法进行高产突变细胞系筛选。进行高产突变细胞系筛选。种子细胞增殖与放大培养
38、种种子子细细胞胞的的增增殖殖与与放放大大培培养养，是是建建立立细细胞胞规规模化培养体系的中间环节。模化培养体系的中间环节。目目的的之之一一是是要要获获得得大大量量的的活活跃跃生生长长的的细细胞胞群群体，为细胞大批量生产准备基础材料。体，为细胞大批量生产准备基础材料。目目的的之之二二是是为为大大体体积积反反应应器器培培养养提提供供技技术术参参数。数。大规模培养体系的建立成批成批培养培养连续连续培养培养半连续半连续培养培养在在一一个个培培养养体体积积中中接接种种细细胞胞和和添添加加培培养养基基后，中途不添加培养基也不更换培养基的方式。后，中途不添加培养基也不更换培养基的方式。其其细细胞胞生生长长动
39、动态态与与实实验验室室摇摇瓶瓶培培养养一一致致，成成典典型型的的“S”“S”生生长长曲曲线线。在在一一个个培培养养周周期期中中，当当细细胞胞生生长长进进入入缓缓慢慢生生长长达达到到静静止止期期时时，往往往往是是细细胞胞次次生生代代谢谢产产物物积积累累的的时时期期，此此时时应应尽尽可可能能维维持持细细胞胞活活性性，延延长长生生产产周周期期，以以便便获获得得较较高的产物积累。高的产物积累。成批培养（成批培养（batch culturebatch culture）成成批批培培养养的的优优点点是是培培养养装装置置和和操操作作简简单单，但但在在培培养养过过程程中中细细胞胞生生长长、产产物物积积累累、以以
40、及及培培养养基基的的物物理理状状态态常常常常随随时时间间变变化化而而变变化化，培培养养检检测测十十分分困困难难。同同时时，成成批批培培养养的的周周期期较较短短，一一个个培培养养周周期期后后细细胞胞和和培培养养液液同同时时取取出出用用于于目目的的产产物物提提取取，下下一一个个培培养养周周期期必必须须重重新新接接种种种种子细胞，因此也增加了培养成本。子细胞，因此也增加了培养成本。在在培培养养的的过过程程中中，不不断断向向反反应应器器中中以以一一定定的的流流量量添添加加新新鲜鲜培培养养基基，同同时时以以相相同同的的流流量量从从系系统统中中取取出出培培养养液液，从从而而维维持持培培养养系系统统内内在在
41、细细胞密度、产物浓度以及物理状态上的相对平衡。胞密度、产物浓度以及物理状态上的相对平衡。连续培养（连续培养（continuous culturecontinuous culture）这这种种培培养养最最大大的的优优点点是是可可以以延延长长细细胞胞培培养养周周期期，从从而而延延长长目目的的产产物物的的积积累累时时间间，增增加加目目的的产产物物产产量量。同同时时，由由于于系系统统进进入入稳稳定定状状态态后后，细细胞胞密密度度、基基质质及及产产物物浓浓度度等等趋趋于于恒恒定定，因因而而便便于于对对系系统统的的检检测测。但但连连续续培培养养装置相对较复杂，对反应器的设计要求较高。装置相对较复杂，对反应
42、器的设计要求较高。这这是是一一种种介介于于成成批批培培养养和和连连续续培培养养之之间间的的培培养养方方式式，其其基基本本方方法法是是在在完完成成上上述述成成批批培培养养的的一一个个周周期期后后，只只从从反反应应器器中中取取出出大大部部分分细细胞胞悬悬液液，保保留留小小部部分分细细胞胞悬悬液液作作为为下下一一培培养养周周期期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养。的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养。半连续培养（半连续培养（semi-continous culturesemi-continous culture）这这种种培培养养方方式式可可以以节节省省种种子子细细胞胞培培养养的的成成本本，同同
43、时时保保留留的的培培养养液液也也有有利利于于细细胞胞分分裂裂启启动动。但但在在大大多多数数情情况况下下，由由于于保保留留细细胞胞悬悬液液中中细细胞胞状状态态有有较较大大差差异异，特特别别是是有有些些衰衰老老细细胞胞不不能能及及时时淘淘汰汰，从从而而会会影响下一培养周期的细胞生长一致性。影响下一培养周期的细胞生长一致性。4.3.2 细胞规模化培养与调控细胞规模化培养与调控规模化细胞生产的重要因素是过程调控。规模化细胞生产的重要因素是过程调控。q反应器类型的选择反应器类型的选择q接种体积接种体积q细胞和环境之间的关系细胞和环境之间的关系反应器类型的选择反应器类型的选择在在大大的的生生物物反反应应器
44、器中中氧氧气气、二二氧氧化化碳碳及及其其他他气气态态代代谢谢物物在在气气相相与与液液相相之之间间的的传传递递、营营养养物物和和溶溶解解气气体体的的均均匀匀分分布布很很难难实实现现。混混合合、质质量量传传递递和和热热传传递递可可用用的的操操纵纵方方法法是是通通气气和和搅搅拌拌，该该方方法法受受到到物物理理、生生物物、力力学学等等条条件件的的限限制制。通通气气和和搅搅拌拌太太剧剧烈烈时时流流体体的的压压力力会会破破坏坏细细胞胞。细细胞胞浓浓度度和和传递现象之间存在着相互作用。传递现象之间存在着相互作用。培培养养后后期期细细胞胞浓浓度度很很高高，细细胞胞尺尺寸寸增增大大，分分泌到细胞外的多糖增多，培
45、养体系变得相当黏稠。泌到细胞外的多糖增多，培养体系变得相当黏稠。规规模模放放大大策策略略就就是是应应用用大大规规模模细细胞胞培培养养的的控控制制机机理理，操操纵纵通通气气和和搅搅拌拌使使过过程程最最优优，在在搅搅拌拌式式反反应应器器内内可可控控制制通通气气和和搅搅拌拌，在在气气升升式式反反应应器器内内可可消消除除搅搅拌拌产产生生的的流流体体压压力力。越越来来越越多多的的新新型型反反应应器器应应用用于于低低剪剪切切力力下下高高密密度度培培养养植植物物细细胞胞，这这些些反反应应器器的的开开发发和和放放大大与与传传统统的的搅搅拌拌式式和和气气升升式式反应器相比仍处于初期。反应器相比仍处于初期。接种体
46、积接种体积q细胞生长需要一定量的接种体积，最小接种体积细胞生长需要一定量的接种体积，最小接种体积一般要比培养体积的一般要比培养体积的10%多，临界接种体积的研多，临界接种体积的研究较多。究较多。q但一些研究表明接种时用过的培养基会刺激细胞但一些研究表明接种时用过的培养基会刺激细胞生长。当接种的废培养基用水代替后，细胞培养生长。当接种的废培养基用水代替后，细胞培养的迟滞时间会延长，最大生长速率会降低。临界的迟滞时间会延长，最大生长速率会降低。临界接种密度与细胞内一些重要代谢物的生产有关。接种密度与细胞内一些重要代谢物的生产有关。q除除了了接接种种浓浓度度，接接种种细细胞胞的的生生理理状状态态也也
47、会会影影响响培培养养周周期期。例例如如，当当接接种种长长春春花花新新生生的的分分裂裂细细胞胞时时，达达到到最最大大细细胞胞浓浓度度的的时时间间缩缩短短了了，而而且且与与生生长长相相关的生物碱产量提高了。关的生物碱产量提高了。细胞和环境之间的关系细胞和环境之间的关系q混合时间混合时间混合时间定义为将液体混合到特定的均一程度混合时间定义为将液体混合到特定的均一程度时所需的时间，取决于气体流动速率以及液体内的气体分时所需的时间，取决于气体流动速率以及液体内的气体分率、搅拌速度、反应器的尺寸和培养液的流变学特性。率、搅拌速度、反应器的尺寸和培养液的流变学特性。q通气通气气流速率大对细胞生长的副作用主要
48、是剪切力增大气流速率大对细胞生长的副作用主要是剪切力增大造成的，同时通气的消极影响还包括造成的，同时通气的消极影响还包括CO2和其他关键的气和其他关键的气体代谢物的去除，因为体代谢物的去除，因为CO2含量过高也会产生负效应。含量过高也会产生负效应。q搅拌搅拌增加搅拌速度可以降低混合时间。另外，搅拌速度增加搅拌速度可以降低混合时间。另外，搅拌速度是流动压力的主要来源。是流动压力的主要来源。q静力学压差静力学压差生物反应器尺寸增大，釜内顶部和底部之间生物反应器尺寸增大，釜内顶部和底部之间的静力学压差增大。静力学压差影响质量传递过程，静力的静力学压差增大。静力学压差影响质量传递过程，静力学压差大最主
49、要的结果是增加了气体的溶解度，气液和液学压差大最主要的结果是增加了气体的溶解度，气液和液气之间的传质推动力增大。气之间的传质推动力增大。q温度控制和热量温度控制和热量q泡沫泡沫细胞培养通气会产生泡沫。培养的细胞容易转移到细胞培养通气会产生泡沫。培养的细胞容易转移到泡沫层，在培养液上层生成了固体膜，这层膜能显著降低泡沫层，在培养液上层生成了固体膜，这层膜能显著降低细胞浓度，应尽量避免。这层膜内的细胞容易缺乏营养，细胞浓度，应尽量避免。这层膜内的细胞容易缺乏营养，营养限制可导致细胞死亡。细胞组分分泌到培养液里可能营养限制可导致细胞死亡。细胞组分分泌到培养液里可能产生副作用。产生副作用。4.3.3
50、目的产物的分离与纯化目的产物的分离与纯化细胞破碎细胞破碎次级代谢物的提取次级代谢物的提取沉淀分离沉淀分离层析分离层析分离萃取分离萃取分离结晶结晶浓缩与干燥浓缩与干燥动物细胞大规模培养方法动物细胞大规模培养方法1 1悬浮培养悬浮培养(suspension culture)(suspension culture)适适用用于于非非贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞，也也可可用用于于兼兼性性贴贴壁壁细细胞胞。其其操操作作方方法法与与植植物物细细胞胞悬悬浮浮培培养养相相似似。该该方方法法的的优优点点在在于于操操作作简简便便，培培养养条条件件比比较较均均一一，传传质质和和传传氧氧条条件件较较好好，容容易易扩扩大