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1、第四章细胞工程本讲稿第一页，共二十六页二、细胞培养技术二、细胞培养技术1、实验室设置、实验室设置细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。无菌操作；控制培养。本讲稿第二页，共二十六页2、细胞培养的基本方法、细胞培养的基本方法n 无菌操作无菌操作 体外细胞培养很容易被微生物所污染。因此体外细胞培养很容易被微生物所污染。因此细胞工程所有的实验都必须在无菌条件下进行。细胞工程所有的实验都必须在无菌条件下进行。无菌操作概念和意识必须贯穿于整个实验过程无菌操作
2、概念和意识必须贯穿于整个实验过程中。中。本讲稿第三页，共二十六页u细胞培养细胞培养 细胞培养（细胞培养（cell culturing）是指动物或植）是指动物或植物细胞在体外无菌和适宜的温度、湿度、光照、物细胞在体外无菌和适宜的温度、湿度、光照、氧气及二氧化碳等条件中保存和生长的过程。氧气及二氧化碳等条件中保存和生长的过程。细胞培养技术是细胞工程的重要技术，细胞细胞培养技术是细胞工程的重要技术，细胞融合、组织工程、胚胎工程、动物克隆、转基融合、组织工程、胚胎工程、动物克隆、转基因技术等都离不开细胞培养。因技术等都离不开细胞培养。本讲稿第四页，共二十六页u细胞融合技术细胞融合技术 细胞融合：两个或
3、多个细胞相互接触后，其细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分于重排，导致细胞合并。细胞膜发生分于重排，导致细胞合并。本讲稿第五页，共二十六页细胞融合的主要过程包括：细胞融合的主要过程包括：制备原生质体。由于微生物及植物细胞具坚硬的细胞壁，制备原生质体。由于微生物及植物细胞具坚硬的细胞壁，因此通常需用酶将其壁降解。动物细胞则无此障碍。因此通常需用酶将其壁降解。动物细胞则无此障碍。诱导细胞融合。两亲本细胞（原生质体）的悬浮液调至一诱导细胞融合。两亲本细胞（原生质体）的悬浮液调至一定细胞密度，按：的比例混合后，逐渐滴入高浓度的聚乙二定细胞密度，按：的比例混合后，逐渐滴入高浓度的聚乙二醇（
4、）诱导融合，或用电激的方法促进融合。醇（）诱导融合，或用电激的方法促进融合。筛选杂合细胞。将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让筛选杂合细胞。将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让杂合细胞有选择地长出，其它未融合细胞无法生长。杂合细胞有选择地长出，其它未融合细胞无法生长。经过上述过程经过上述过程 就这样获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。就这样获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。本讲稿第六页，共二十六页融合剂融合剂n病毒融合剂：病毒融合剂：DNA病毒；病毒；RNA病毒病毒n化学融合剂化学融合剂 PEG等等n电融合技术电融合技术 特异性和非特异性特异性和非特异性本讲稿第七页，共二十六页植物细胞融合流程植
5、物细胞融合流程在无菌条件下按比例混合双亲原生质在无菌条件下按比例混合双亲原生质滴加滴加PEG溶液，溶液，摇匀，静置匀，静置滴加高滴加高PH值、高、高钙离子的溶液，离子的溶液，摇匀，静置匀，静置滴滴加原生加原生质体培养液洗体培养液洗涤数次数次离心离心获得原生得原生质体体细胞胞团筛选、再生、再生杂合合细胞胞本讲稿第八页，共二十六页动物细胞融合流程动物细胞融合流程 双亲本细胞双亲本细胞分分别制成制成细胞胞悬液液混合离心混合离心双双亲细胞沉淀胞沉淀弃上清液弃上清液灭活仙台病毒悬液灭活仙台病毒悬液 混匀混匀冰浴冰浴20min 间歇摇动间歇摇动细胞细胞凝聚凝聚细胞细胞 融合融合 3730min30min间
6、歇摇动间歇摇动选择培选择培养养本讲稿第九页，共二十六页植物组织培养图示为：植物组织培养图示为：预备阶段预备阶段诱导去分化阶段诱导去分化阶段继代增殖阶段继代增殖阶段生生根成芽阶段根成芽阶段移栽成活阶段移栽成活阶段1、目的、目的:通过组织培养方法培养完整植株。通过组织培养方法培养完整植株。2、意义：通过组织培养使植物能够进行快速繁殖，多、意义：通过组织培养使植物能够进行快速繁殖，多种具有重要的经济价值的植物实现了大规模的工业化、种具有重要的经济价值的植物实现了大规模的工业化、商品化生产。商品化生产。三三 植物组织培养植物组织培养本讲稿第十页，共二十六页四、四、植物细胞培养植物细胞培养植物细胞培养植
7、物细胞培养:是指把高等植物的细胞从植是指把高等植物的细胞从植物体内分离出来，并在比较简单的培养基中进物体内分离出来，并在比较简单的培养基中进行培养。行培养。本讲稿第十一页，共二十六页工业化植物细胞培养系统的特性：植物细胞培养目的：通过组织培养方法培育完整植株；本讲稿第十二页，共二十六页植物细胞培养意义：植物细胞培养意义：.许多杂合的重要经济作物通常是以无性方式繁殖许多杂合的重要经济作物通常是以无性方式繁殖-植物细胞培植物细胞培养，可以保存每一栽培品系的优良性状；养，可以保存每一栽培品系的优良性状；.培养用于无性繁殖，大大增加了无性繁殖的范围和潜力，培养用于无性繁殖，大大增加了无性繁殖的范围和潜
8、力，细胞培养能够提高繁殖速度，一个优良品种，用细胞培养再分细胞培养能够提高繁殖速度，一个优良品种，用细胞培养再分化植株的方法，在几个月内就能大面积种植，而常规的育种法化植株的方法，在几个月内就能大面积种植，而常规的育种法需要好几年；需要好几年；.胞培养能使以前不能进行无性繁殖的植物易于繁殖；胞培养能使以前不能进行无性繁殖的植物易于繁殖；.物细胞培养在生物科学研究以及提供医药产品等方面也物细胞培养在生物科学研究以及提供医药产品等方面也有着广阔的情景。有着广阔的情景。本讲稿第十三页，共二十六页培养方法培养方法 1、悬浮培养系统、悬浮培养系统.半连续培养方法，目每隔一定时间（如半连续培养方法，目每隔
9、一定时间（如1-2天）收获部分培养物，再加人等量培养基的方天）收获部分培养物，再加人等量培养基的方法。法。.连续培养方法，即培养若于天后连续收获连续培养方法，即培养若于天后连续收获细胞的同不断补充培养液的方法。细胞的同不断补充培养液的方法。本讲稿第十四页，共二十六页2、固定化细胞培养系统固定化细胞培养系统 细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。内部或贴附在它的表面。固定化细胞培养系统有以下两大类：固定化细胞培养系统有以下两大类：平床培养系统和立柱培养系统平床培养系统和立柱培养系统 本讲稿第十五页，共二十六页本讲稿第十六页，共二十六页本讲稿
10、第十七页，共二十六页5、植物细胞大规模培养与次生代谢产物生产、植物细胞大规模培养与次生代谢产物生产 植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化和物，其产物生长发育所必需的小分子有机化和物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。程称为次生代谢。本讲稿第十八页，共二十六页 植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。业等领域具有重要意义。许多植物
11、次生代谢产物是优良的食品添加许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料（姜精油剂和名贵化妆品原料（姜精油）。有些是生物）。有些是生物毒素（致热素）的主要来源，可以用于杀虫、毒素（致热素）的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。品。本讲稿第十九页，共二十六页植物次生代谢产品的市场潜能植物次生代谢产品的市场潜能产品成分产品成分用途用途年销售额（亿美元）年销售额（亿美元）长春花碱长春花碱治疗白血病治疗白血病1820（美国）（美国）阿吗灵阿吗灵循环系统障碍药循环系统障碍药525（全世界）（全世界）奎宁奎宁治疗疟疾治疗疟疾
12、510（美国）（美国）致热素致热素杀虫剂杀虫剂20（全世界）（全世界）毛地黄毛地黄心脏病药心脏病药2055（美国（美国本讲稿第二十页，共二十六页五、动物细胞工程五、动物细胞工程 一、转基因动物和克隆动物一、转基因动物和克隆动物 1、克隆动物、克隆动物 （1）克隆：无性繁殖的后代群体。）克隆：无性繁殖的后代群体。1902年德国年德国Haberlandt指出植物细胞具有全能性。指出植物细胞具有全能性。20世纪世纪30年代年代Spemann提出提出“分化了的细胞核移入去核卵分化了的细胞核移入去核卵子中构建新胚胎子中构建新胚胎”1996年年“Dolly”诞生诞生 本讲稿第二十一页，共二十六页多莉和它的
13、母体多莉和它的母体 本讲稿第二十二页，共二十六页克隆羊的过程克隆羊的过程 本讲稿第二十三页，共二十六页（2）动物克隆技术）动物克隆技术 动物克隆技术包括细胞核移植技术、卵裂动物克隆技术包括细胞核移植技术、卵裂球培养、胚胎分割技术。球培养、胚胎分割技术。根据供体对象不同细胞核移植技术可分为根据供体对象不同细胞核移植技术可分为胚胎细胞、干细胞核和体细胞核移植技术。胚胎细胞、干细胞核和体细胞核移植技术。本讲稿第二十四页，共二十六页六、动物细胞融合与单克隆抗体六、动物细胞融合与单克隆抗体1、单克隆抗体、单克隆抗体n 当外源生物（细菌等）或生物大分子（蛋白质）当外源生物（细菌等）或生物大分子（蛋白质），
14、即抗原，进入动物或人体后，会刺激后者产，即抗原，进入动物或人体后，会刺激后者产生相应的抗体，引起免疫应答，从而将前者分生相应的抗体，引起免疫应答，从而将前者分解或清除。解或清除。人或哺乳动物体内有两类淋巴细胞：人或哺乳动物体内有两类淋巴细胞：T淋淋巴细胞和巴细胞和B淋巴细胞。淋巴细胞。本讲稿第二十五页，共二十六页u从某个特定的从某个特定的B淋巴细胞培养出大量的细胞群，淋巴细胞培养出大量的细胞群，即克隆，如此克隆的细胞其遗传特性高度一致，即克隆，如此克隆的细胞其遗传特性高度一致，由它们分泌出的抗体称单克隆抗体。由它们分泌出的抗体称单克隆抗体。但淋巴细胞在体外不能无限分裂繁殖，而但淋巴细胞在体外不能无限分裂繁殖，而肿癌细胞特别是瘤细胞具有无限增殖的特性，肿癌细胞特别是瘤细胞具有无限增殖的特性，1975年年Kohler和和Milstein将从将从Lakes身上取下身上取下的的“Hela”癌细胞融合，获得了既能产生单一癌细胞融合，获得了既能产生单一抗体又能在体外无限生长的杂合细胞，并于抗体又能在体外无限生长的杂合细胞，并于1984年获得诺贝尔生理学与医学奖。年获得诺贝尔生理学与医学奖。本讲稿第二十六页，共二十六页