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1、动物细胞工程1本章主要内容：培养细胞的生物学特性常用培养液的组成和配制细胞培养的基本方法细胞系和细胞株的建立细胞冻存复苏等细胞培养的技术第四章 细胞培养24.1 培养细胞的生物学特征34.1.1 体外培养细胞的分型 1.贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：上皮细胞型成纤维细胞型游走细胞型多形型细胞2.悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。4 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细
2、胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。上皮细胞型：乳腺癌细胞5 胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。成纤维细胞型：6游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。单核细胞、巨噬细胞等。7多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可
3、统归于此类。神经元神经胶质细胞。89 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。2.悬浮型概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)104.1.2 培养细胞的生长特点 1.贴附贴附并伸展是贴壁细胞体外培养时的基本生长特点。11 体外培养的小鼠子宫上皮细胞(a)消化分离得到
4、的细胞团块；(b)生长至第3天的细胞单层；(c)生长至第4天的细胞单层；(d)生长至第6天的细胞单层124.1.2 培养细胞的生长特点 2.接触抑制 接触抑制是体外培养中某些贴附型细胞生长特性之一。一般情况下，正常细胞不停顿的活动或移动，其外周的细胞膜呈现一些特征性皱褶样活动。但是，当两个细胞由于移动而相互靠近发生接触时，细胞不再移动，在接触区域的细胞膜皱褶样活动停止，从而使细胞停止运动。这种由细胞接触而抑制细胞运动的现象称为接触抑制。134.1.2 培养细胞的生长特点 2.接触抑制 由于细胞之间有接触抑制生长特性，一般正常生长细胞并不互相重叠于其上而生长，而是呈单层生长。但是肿瘤细胞由于无接
5、触抑制而能够继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积。因此，（接触抑制）可作为区分正常细胞与癌细胞的标志之一。144.1.2 培养细胞的生长特点 3.密度抑制 细胞接触汇合后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，数量仍然增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。154.1.3 培养细胞的生长和增殖过程 细胞系的生长过程分为：原代培养期、传代期和衰退期。16n 细胞系的生长过程原代培养期原代培养期传代期传代期衰退期衰退期为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的
6、时期。原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，此时，便应将原代细胞分开接种至2个或更多的新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰退死亡。17每代细胞的生长过程 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增(Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。183.组织培养细胞一代生存期细胞传
7、一代后，一般要经过以下三个阶段：潜伏期（Latent Phase）;指数生长期（Logarithmic growth Phase）;停止期/平台期（Stagnate Phase）.19理想的实验用细胞204.1.5 体内外细胞的差异和分化21(1)主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 可能出现脱分化或去分化 细胞趋向单一化；4.1.5 体内外细胞的差异和分化22（2）与体内主要不同点 相对孤立、相对单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响(3)提示 要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体。234.2 细 胞 培 养 液244.2.1 细 胞 的 常 用 液
8、 体251.水：新鲜配置的三蒸水或超纯水2.平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)又称生理盐水或盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。常用的缓冲液：生理盐水、PBS、PBS(注意有无钙镁离子)、Hanks液（含有钙镁离子、葡萄糖、酚红）配液时注意：（1）用水；配制先后顺序；称量，要看清药品的规格、纯度、结晶水的数量等。（2）物质的纯度，常用的纯度有优级纯(特级纯)，分析纯（AR）和化学纯（CD）三种。（3）物质的可溶性，避免沉淀析出。（4）物质的稳定性，如葡萄糖只能在10磅下维持1520分钟。
9、（5）贮存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前临时混合和稀释，过滤除菌备用。263胶原酶0.25%274.pH调节液(1)碳酸氢钠液 可根据需要与使用方便配制10%以下的各种浓度。先用双蒸水溶解后，需经过滤除菌，分装小瓶中。亦可使用高压蒸气灭菌，密封，4冰箱保存。市售有5%10%浓度的安瓿封装品，使用也很方便。在调节pH过程中或超过要求值时，可用高压灭菌的10%醋酸溶液或以CO2调节之。(2)Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂。通常使用浓度为1015mmol/L。配制时，称取所需的Hepes量，用培养液溶解，用1mmol/LNaOH调节
10、pH至7.0，过滤除菌分装小瓶中，4冰箱保存。285 抗生素溶液(PS)为防止细胞培养过程中发生污染，一般在培养液中加入青霉素钠盐和硫酸链霉素，其浓度分别为每毫升含100U和100g。配制时取青霉素1106和链霉素1106g,溶于100ml Hanks或PBS中，使其含量为青霉素1104U/ml，链霉素1104g/ml，使用时每100ml培养液中加入0.5-1ml。296.307.314.2.2 细 胞 培 养 基32营 养 需 要基本营养物质：包括氨基酸、维生素、碳 水化合物及一些无机离子。促生长因子：体外培养细胞既需要上述基本营养 物质，还需要促细胞生长因子等物 质才能正常生长、繁殖。血清
11、中含 有多种这类物质，有利于多数细胞的存活和生长。RPMI-1640培养液1020%FBS334.2.1细胞培养基细胞培养基组成培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液分为天然培养基和合成培养基。341.培养基u 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好。缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。35合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC1
12、99、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。36基本培养基的种类P252附表4MEMDMEMIMDMRPMI1640M199、M109HamF12McCoy5A3738394.2.2 培养基的配制（1）基础培养基的配制 仔细阅读说明书 配制要保证充分溶解 配制所用水应为超纯水40 合成培养基（粉）1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至1000ml 过滤除菌，调节pH值至7.2 基础培养基的配制
13、41基础培养基 80一95血清 5一20（2）完全培养基有血清培养基的配制42 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；多种金属离子；激素；各种生长因子；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；胰酶抑制因子；转移蛋白；不明成分。血 清43 一般说来，含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加10血清。对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血
14、清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。血清的作用44 血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56，30 分钟。血清的消毒：过滤除菌。血清的使用452.培养基的配制（3）无血清培养基u 基础培养基添加成分46 无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可
15、重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。F12DMEM 添加成分（ECM、营养成分、生长因子、酶的抑制剂、结合蛋白、转运蛋白）（3）无血清（无酚红）培养基配制2.培养基的配制474.3 细胞的基本培养技术48 4.3.1.原代细胞培养 是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。最接近和反应体内生长特性491.组织取材2.组织细胞分离 机械法 消化法 3.培养方法（1）组织块（2）单层细胞培养
16、（3）悬浮细胞培养50组织块培养法51Step 1 将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。实验1 成年小鼠肾脏细胞原代培养（组织块培养法）52n Step 2 将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔 53Step 3 用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥向肾门，去肾外膜及脂肪，54Step 4 剪碎组织55Step5 接种组织块56n 移入培养箱中（注意贴有组织块的一面朝上），n n 静止23小时，然后将细胞培养瓶轻轻翻转，继续静止培养。57观察n 2448小时后若培养液变成黄色且混浊，表示已被污染；n 若培养液变成紫色，一般细胞生长不好，则培养液pH过高；n 若
17、培养液显为橙黄、橘红且清澈，一般显示细胞生长良好。在相差显微镜下观察，若此时见细胞自组织边缘长出。n 继续培养35日，再换部分或全部培养液，待多数组织块的生长晕相接，小心挑掉组织块，继续培养34天，细胞贴满细胞培养瓶壁时便可进行传代培养。58请观看视频教程！新生乳鼠心肌细胞原代培养594.3.2 传代培养 细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称为传代或者再培养。在体外传代的细胞生长一代包括3个过程：潜伏期、生长对数期、平台期。传代培养分为：原代培养后第一次传代和常规传代601.第一次传代培养 当原代细胞生长到一定阶段时，可以进行第一次传代。从原代培养到第一次传代的时间取决于原代培养的
18、方法、培养细胞的活性、细胞类型和特点、接种的细胞密度、培养条件等。612.常规传代培养（1）悬浮培养细胞传代（2）贴壁细胞的消化法传代62消化传代的步骤消化法传代培养步骤（2）贴壁细胞的消化法传代63用胰蛋白酶消化传代ab cd e f64贴壁细胞的消化法传代应注意：1)适时传代2)不同细胞的传代要区别对待3)消化液浓度要适宜4）次传代的细胞接种数量可适当多一些654.5 细胞的冻存、复苏和运输66细胞冻存和复苏n 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。67冻存n 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细
19、胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。n 应用低温保护剂和改进冻融方法68低温保护剂的应用n 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。n 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。69细胞冻存方法n 预先配制冻存液：含20%血清培养基10%DMSO n 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)n 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。n 1
20、 年后，存活率可达80-90。DMSO液用培养液配好，n 避免因临时配制产热而伤害细胞。70冻存和复苏的原则：慢冻快融 n 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。n 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。71慢冻程序标准程序：当温度在-25 以上时，12/min 当温度达-25 以下时，510/min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器简易程序 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停
21、30分钟后，直接投人液氮中。72细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。73请观看视频教程！细胞复苏、传代、冻存74 4.3.3 常用培养技术 1.悬滴培养 2.培养瓶培养 3.旋转管培养 4.克隆培养法 5.细胞同步化培养 75 4.3.3 常用培养技术5.细胞同步化培养（1）选择细胞同步化：M期细胞震摇脱落法 离心洗脱法 梯度沉降法 76 4.3.3 常用培养技术5.细胞同步化培养（1）选择细胞同步化：（2）诱导同步化：血清饥饿 异
22、亮氨酸营养缺乏 DNA合成抑制剂 秋水仙素 77 4.3.3 常用培养技术 1.悬滴培养 2.培养瓶培养 3.旋转管培养 4.克隆培养法 5.细胞同步化培养 6.动物细胞的大规模培养784.4 细胞系和细胞株的建立79细胞系（cell line）是由原代培养经初步纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。细胞系经过进一步的克隆化，便得到由单一细胞组成的细胞株。804.4.1 种类1.初代培养2.细胞系3.克隆细胞株4.二倍体细胞5.遗传缺陷细胞6.肿瘤细胞系或株814.4.2 建立细胞系的要求1.组织来源2.细胞生物学检测3.培养条件和方法824.4.3 细胞系的鉴定1.鉴定指标(1)纯度(2)细胞学特征(3)稳定性(4)污染情况834.4.3 细胞系的鉴定2.鉴定方法(1)细胞形态学观察(2)绘制生长曲线，计算分裂指数(3)染色体组型和带型分析(4)同工酶酶谱检测844.4.3 细胞系的鉴定3.档案资料的管理和使用8586