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1、 单克隆抗体单克隆抗体 Monoclonal Antibody 单克隆抗体单克隆抗体(McAb)1975 1975年英国科学家年英国科学家Milstein和和Kohler将产生抗体将产生抗体 的的淋巴细胞淋巴细胞同同肿瘤细胞肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗融合，成功建立了单克隆抗 体技术，而获得体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。年诺贝尔医学和生理学奖。每个每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某 种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限 增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内增殖，因此杂交瘤
2、细胞可在体外培养或移植到体内 条件下分泌大量结构与特性相同的高纯度抗体。条件下分泌大量结构与特性相同的高纯度抗体。单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗 原分子大量制备纯一的单克隆抗体。原分子大量制备纯一的单克隆抗体。单抗的特点单抗的特点1.高度均质性高度均质性-始于一个始于一个B细胞的单细胞的单克隆系克隆系,均质均质2.高度特异性高度特异性-针对单个抗原决定针对单个抗原决定簇反应簇反应,一般无交叉反应一般无交叉反应3.来源稳定来源稳定,产量大产量大探讨蛋白质的精细结构；探讨蛋白质的精细结构；淋巴细胞亚群的表面新抗原分析；淋巴细胞亚群的表面新抗原分
3、析；组织相容性抗原；组织相容性抗原；激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；肿瘤的定位和分类；肿瘤的定位和分类；纯化微生物和寄生虫抗原；纯化微生物和寄生虫抗原；免疫免疫-化学疗法（化学疗法（“导弹导弹”疗法，疗法，利用单克隆抗体与靶细利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部胞特异性结合，将药物带至病灶部 位）。可直接用于人类位）。可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机 制的研究。制的研究。应应 用用杂杂交交瘤瘤细细胞胞产产生生 单单克克隆隆抗抗体体示示意意图图性性 质质常规血清抗体常规血清抗体单克隆抗体单克隆
4、抗体抗体含量抗体含量少少 g/mlg/ml多多 mg/ml无关的无关的Ig多多少或几乎无少或几乎无其它血清蛋白其它血清蛋白有有少，培养物上清常有少，培养物上清常有10胎牛血清胎牛血清Ag-Ab结合结合免疫原的全部成分的全部免疫原的全部成分的全部抗原决定簇抗原决定簇免疫原中的一种成分的免疫原中的一种成分的一个抗原决定簇一个抗原决定簇特异性亲和力的重复性特异性亲和力的重复性不同批号间有变化不同批号间有变化无变化无变化与其它抗原的交叉反应与其它抗原的交叉反应与带有共同抗原决定簇的与带有共同抗原决定簇的抗原有部分交叉抗原有部分交叉一般无。结合到共同决一般无。结合到共同决定簇则是完全的定簇则是完全的免疫
5、球蛋白的种类与亚类免疫球蛋白的种类与亚类完全是混合的完全是混合的只是一种或几种只是一种或几种免疫球蛋白的物理性质免疫球蛋白的物理性质典型光谱典型光谱抗体的单一性质抗体的单一性质单抗与多抗单抗与多抗主要步骤包括：主要步骤包括：（1）抗原制备；）抗原制备；（2）免疫动物；）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；（4）细胞融合；）细胞融合；（5）杂交瘤细胞的选择培养；）杂交瘤细胞的选择培养；（6）杂交瘤细胞的筛选；）杂交瘤细胞的筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化；）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定；）单克隆抗体的检定；（9）单克隆抗体的大量制备。）单克隆
6、抗体的大量制备。一一 、抗原提纯与动物免疫、抗原提纯与动物免疫 对抗原的要求是纯度越高越好对抗原的要求是纯度越高越好1 细胞抗原细胞抗原-可取可取1107个细胞作腹腔免疫个细胞作腹腔免疫2 可溶性抗原可溶性抗原-需加完全福氏佐剂并经充分乳化需加完全福氏佐剂并经充分乳化3 聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原-可将抗原所在的电泳条带可将抗原所在的电泳条带 切下，切下，研磨后直接用以动物免疫。研磨后直接用以动物免疫。选择选择BALB/c健康小鼠，鼠龄在健康小鼠，鼠龄在812周，雌雄不限。同时周，雌雄不限。同时免疫免疫34只小鼠。只小鼠。免疫过程因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得
7、免疫过程因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般23周。共计三到四次周。共计三到四次。分离脾细胞融合前分离脾细胞融合前34天加强免疫一次。天加强免疫一次。二二、三种细胞三种细胞 1 Sp2/0(骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞)本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。融合细 胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。2 饲养细胞饲养细胞在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入饲养细胞（feedercell）。常用的为小鼠的腹腔细胞。在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否
8、则所获细胞会有严重污染。小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠腹腔巨噬细胞的制备拉颈处死浸泡于拉颈处死浸泡于75酒精，消毒酒精，消毒35分钟分钟用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌注射器注入用无菌注射器注入68ml培养液培养液反复冲洗，吸出冲洗液反复冲洗，吸出冲洗液放入放入10ml离心管，离心管，1200转分离心转分离心56分钟分钟用用20小牛血清小牛血清(NCS)的培养液混悬，调整细胞数的培养液混悬，调整细胞数110ml加入加入96孔板，孔板，100l孔孔放入放入37孵箱培养孵箱培养3 免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋淋巴母细胞
9、。一般取最后一次加强免疫巴母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后天以后的脾脏，制备成细胞悬液，的脾脏，制备成细胞悬液，脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的倍，细胞数为的倍，细胞数为10左右。左右。三三、细胞融合、细胞融合分别收集洗涤和并计数将两种细胞混合后加分别收集洗涤和并计数将两种细胞混合后加PEG(聚乙二醇聚乙二醇)
10、使细胞彼此融合。其后培养液稀释使细胞彼此融合。其后培养液稀释PEG，消除，消除PEG的作用。的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。注意问题注意问题细胞比例细胞比例：常用：常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。有较高活性。反应时间反应时间：轻柔操作。在两种细胞的混合细胞悬液中，第：轻柔操作。在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加滴加ml培养液；第培养液；第2min滴加滴加ml培养液，尔后培养液，尔后min加培养液加培养液0ml。培养液的成分培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重
11、要，其中：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。效率降低，应随时核查培养基情况。四、四、HAT选择杂交瘤选择杂交瘤选择性培养的选择性培养的目的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用般采用HAT选择性培养基。在选择性培养基。在HAT培养基中，未融合培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤次黄嘌呤-鸟嘌呤鸟嘌呤-磷酸核糖转移磷酸核糖转移酶酶，不能利用补救途径合成，不能利用补救途径合成DNA而死亡。而死亡。未融合的未融合的淋巴
12、细胞虽具有次黄嘌呤淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。培养基中存活和增殖。次黄嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶核苷五、杂交瘤细胞的克隆化五、杂交瘤细胞的克隆化有限稀释法有限稀释法制备饲养细胞悬液(同融合前准备)阳性孔细胞的计数取130个细胞放入6.5ml含
13、饲养细胞完全培养液，即20个细胞ml，100l孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个ml，100l孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个ml，100l孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。培养45天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200l孔。第89天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。六、单克隆抗体的鉴定六、单克隆抗体的鉴定1.抗体特异性的鉴定：方法可用抗体特异性的鉴定：方法可用ELISA法。法。2.McAb的的Ig类与亚类的鉴定类与
14、亚类的鉴定3.McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果的生物学活性。例如如果确定抗病毒确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。或细胞是否得到抗体的保护。4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原所识别抗原位点，来确定位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。
15、的识别的表位是否相同。5.McAb亲和力的鉴定：用亲和力的鉴定：用ELISA或或RIA竞竞争结合试验来确定争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。与相应抗原结合的亲和力。七、单克隆抗体的大量生产七、单克隆抗体的大量生产体内接种杂交瘤细胞，制备腹水。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水。腹腔注射腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管
16、中，一般一只小鼠可获一只小鼠可获110ml腹水。也可用注射器抽取腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水，可反复收集数次。八:细胞的冻存与复苏-慢冻快复（一）保存 连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移丢失产生抗体的特性。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：1材料(1)细胞：取对数生长期的细胞。(2)10二甲基亚砜保护液：含10二甲基亚砜、20灭活胎牛血清，70RPMI1640液。(3)20FCS1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100g/ml。(4)灭菌的2ml安瓶等2操作方法(1)去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10FCS1640液，使细胞悬浮。(3)1 00
17、0r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10二甲基亚砜保护液制成悬液。(4)用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml1.0ml，熔封安瓶。(5)放4 2h。(6)放液氮罐气态部分（-70）15h。(7)转入液氮部分。（二）复苏二）复苏1从液氮罐中取出安瓶立即放37水浴中速溶。2无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。3逐滴缓慢加入20FCS1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。45CO2饱和湿度，37培养。54h后弃去培养液上清，加入新鲜的20FCS1640培养液。6继续培养，换液，以至形成单层。主要失败原因和影响因素有主要失败原因和影响因素有:1.污染污染：包括细菌、霉
18、菌和支原体的污染。：包括细菌、霉菌和支原体的污染。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于将污染的杂交瘤细胞注射于BALBc小鼠的腹腔，小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。般可除去
19、支原体污染。2.融合后杂交瘤不生长融合后杂交瘤不生长：PEG有毒性或作用时间过长有毒性或作用时间过长牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选骨髓瘤细胞污染了支原体骨髓瘤细胞污染了支原体HAT有问题，主要是有问题，主要是A含量过高或含量过高或HT含量不足含量不足3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。抵抗细胞所致。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。有可能是免疫
20、原抗原性弱，免疫效果不好。对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。三要三要:要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆。要定期进行再克隆。三不要三不要:不要让细胞不要让细胞“过度生长过度生长”。因为非分泌的杂交瘤。因为非分泌的杂交
21、瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。个月。不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。形式连续传好几代。4.杂交瘤细胞难以克隆化杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。