单克隆抗体制备讲稿.ppt

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1、关于单克隆抗体制备关于单克隆抗体制备第一页，讲稿共三十页哦免疫血清和单克隆抗体的制备免疫血清和单克隆抗体的制备第二页，讲稿共三十页哦一、免疫血清的制备一、免疫血清的制备1.原理：原理：机体具有多种机体具有多种B细胞克隆，细胞克隆，将适当的抗原物质注入人或动物将适当的抗原物质注入人或动物体内体内后可被不同的后可被不同的B细胞克隆同时识别，细胞克隆同时识别，经过一定时间，经过一定时间，受刺受刺激的激的B细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相应的特异性抗细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相应的特异性抗体，每一抗原表位都能诱发相应体，每一抗原表位都能诱发相应B细胞克隆产生单克隆抗体，细胞克隆产生单克隆抗体，

2、此获得的血清即为含多种单克隆抗体的混合物，称之为多克隆抗此获得的血清即为含多种单克隆抗体的混合物，称之为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。体免疫血清，简称免疫血清。优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免疫途径、性，以及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。第三页，讲稿共三十页哦免疫原免疫原1.1.抗原种类抗原种类抗原种类抗原种类 微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋白抗原。微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋

3、白抗原。微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋白抗原。微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋白抗原。2.抗原纯度抗原纯度抗原纯度抗原纯度 一般的抗原只要达到亲合层析或一般的抗原只要达到亲合层析或SDSSDSPAGEPAGE电电电电 泳纯即可。泳纯即可。泳纯即可。泳纯即可。3.3.抗原用量抗原用量 在一定范围内与免疫应答强度呈正相关。在应在一定范围内与免疫应答强度呈正相关。在应 用完全弗氏佐剂时，蛋白质类抗原剂量以用完全弗氏佐剂时，蛋白质类抗原剂量以0.5 1mg/kg体重为宜，加强免疫约为基础剂量的体重为宜，加强免疫约为基础剂量的体重为宜，加强免疫约为基础剂量的体重为宜，加强免疫约为基础剂量的 1/21/21

4、/3。第四页，讲稿共三十页哦4.抗原的处理抗原的处理1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数剂，直接免疫。菌体数11010个个/ml 为宜。为宜。2）可溶性蛋白质抗原（如人）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂 （1：1 V/V）混合、乳化。）混合、乳化。3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载 体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA

5、）、钥）、钥 孔嘁血蓝素孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联 剂。剂。第五页，讲稿共三十页哦佐佐 剂剂1.1.概念概念概念概念 佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注入佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注入佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注入佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应答的类型。机体时，可增强机体免疫

6、应答或改变免疫应答的类型。机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应答的类型。机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应答的类型。2.种类种类 1）卡介苗（）卡介苗（）卡介苗（）卡介苗（BCGBCG）、短小棒状杆菌（）、短小棒状杆菌（）、短小棒状杆菌（）、短小棒状杆菌（CP）、脂）、脂 多糖（多糖（多糖（多糖（LPS）、细胞因子；）、细胞因子；）、细胞因子；）、细胞因子；2 2）氢氧化铝、明矾；）氢氧化铝、明矾；）氢氧化铝、明矾；）氢氧化铝、明矾；3 3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly Ipoly I：C）和双）和双 链多

7、聚腺苷酸：鸟苷酸（链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U U）；）；4 4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物 （ISCOMsISCOMs）、）、CPGCPG寡核苷酸。寡核苷酸。寡核苷酸。寡核苷酸。第六页，讲稿共三十页哦3.弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂 1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。2）配方：羊毛脂：液体石蜡）配方：羊毛脂：液体石蜡 为为1：2，也可，也可1：1。灭活卡介苗灭活卡介苗（2 2 20mg/ml20mg/ml）。）。4.弗氏不完全佐剂，成分不含卡介

8、苗，其他同弗氏佐弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐 剂。剂。5.用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳化。用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳化。第七页，讲稿共三十页哦动动 物物 选选 择择对免疫动物的主要要求有：对免疫动物的主要要求有：1.1.应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制 备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源 生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫应答能力越生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫应答能力

9、越 强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。2.动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家 兔初始免疫体重通常在兔初始免疫体重通常在兔初始免疫体重通常在兔初始免疫体重通常在2 22.5kg2.5kg。3.3.性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊性别上

10、以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊 娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或 应用免疫抑制剂的动物。应用免疫抑制剂的动物。应用免疫抑制剂的动物。应用免疫抑制剂的动物。第八页，讲稿共三十页哦免疫方法免疫方法免疫方法免疫方法1.免疫途径免疫途径免疫途径免疫途径 1）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和 淋巴结等。淋巴结等。2 2）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。3）颗粒性抗原（

11、细菌悬液、红细胞悬液）采用小）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小 鼠腹腔注射。鼠腹腔注射。鼠腹腔注射。鼠腹腔注射。4）可溶性抗原（如）可溶性抗原（如）可溶性抗原（如）可溶性抗原（如IgGIgG）采用弗氏完全佐剂的乳）采用弗氏完全佐剂的乳）采用弗氏完全佐剂的乳）采用弗氏完全佐剂的乳 剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。第九页，讲稿共三十页哦2.可溶性抗原免疫可溶性抗原免疫 1）方法：基

12、础免疫（初次免疫）后三周左右，进行）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行 加强免疫，以后每隔加强免疫，以后每隔2周加强免疫一次。周加强免疫一次。2）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验 测定血清效价测定血清效价1：32或或ELISA法测定抗体效价法测定抗体效价 1：10 000，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉 或心脏全部血液，分离血清。或心脏全部血液，分离血清。4）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需）如抗体效价较低，继续加

13、强免疫，一般需45 次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免 疫。疫。3.颗粒性抗原免疫颗粒性抗原免疫 第一周注射第一周注射2次，随后每周加强免疫次，随后每周加强免疫1次，次，45天天 试血。试血。第十页，讲稿共三十页哦3.操作程序操作程序 1）健康雄性家兔体重）健康雄性家兔体重2.5 3 kg，背部皮下多点注射。，背部皮下多点注射。2）基础免疫：抗原完全佐剂）基础免疫：抗原完全佐剂(抗原剂量抗原剂量4mg/只只)2ml (1:1V/V)吸入两支注射器内，三通连接，吸入两支注射器内，三通连接，反复推拉混合至乳化悬液。反复推拉混合至乳化悬液。3）加强免

14、疫：抗原不完全佐剂）加强免疫：抗原不完全佐剂(抗原剂量抗原剂量2.5mg/只只)，间隔间隔710天加强一次。约天加强一次。约23次。次。4）试）试 血：末次注射后第血：末次注射后第7天取少量静脉血，免疫双天取少量静脉血，免疫双 扩试验血清检测，抗血清效价扩试验血清检测，抗血清效价 1：32（或（或 ELISA法检测抗体效价法检测抗体效价1：10，000）时颈）时颈 动脉放血，分离血清，分装，保存。动脉放血，分离血清，分装，保存。第十一页，讲稿共三十页哦二二 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 1975年年 Kohler和和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红

15、细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪这项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪元。元。第十二页，讲稿共三十页哦 1.1.原理原理原理原理 根据致敏的单一根据致敏的单一B细胞克隆具有分泌特异性抗体和骨髓细胞克隆具有分泌特异性抗体和骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性，采用细胞融合技术在体外可瘤细胞在体外长期增殖的特性，采用细胞融合技术在体外可将上述两种细胞融合形

16、成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞因具备了将上述两种细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞因具备了B B细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，即可分泌抗体，又能在细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，即可分泌抗体，又能在细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，即可分泌抗体，又能在细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，即可分泌抗体，又能在HAT培养基中长期存活。因此，可通过培养基中长期存活。因此，可通过HAT选择性培养，筛选选择性培养，筛选选择性培养，筛选选择性培养，筛选出克隆化目的杂交瘤细胞株，再利用杂交瘤细胞培养上清或出克隆化目的杂交瘤细胞株，再利用杂交瘤细胞培养上清或出克隆化目的杂交瘤细胞株，再利用杂交瘤细胞培养上清或出克隆化目的杂交瘤细胞株，

17、再利用杂交瘤细胞培养上清或杂交瘤细胞接种小鼠产生的腹水，获取大量的来源于杂交瘤杂交瘤细胞接种小鼠产生的腹水，获取大量的来源于杂交瘤杂交瘤细胞接种小鼠产生的腹水，获取大量的来源于杂交瘤杂交瘤细胞接种小鼠产生的腹水，获取大量的来源于杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体（细胞分泌的单克隆抗体（细胞分泌的单克隆抗体（细胞分泌的单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）。）。第十三页，讲稿共三十页哦 2.试剂与器材试剂与器材（1）细胞融合剂：聚乙二醇（）细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）（2）0.2mol/L L-谷氨酰胺贮存液谷氨酰胺贮存液（3）200 双抗（青、链霉素）溶液双抗（青、链霉素）溶液

18、（4）RPMI-1640培养液培养液（5）15%胎牛血清胎牛血清RPMI-1640培养液培养液（6）100 氨基蝶呤（氨基蝶呤（A）贮存液）贮存液（7）100 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（8）1 HAT培养液培养液（9）1 HT培养液培养液（10）100 8-杂氮鸟嘌呤贮存液杂氮鸟嘌呤贮存液第十四页，讲稿共三十页哦（11）细胞冻存液：）细胞冻存液：90ml含含30%FCS的的RPMI-1640培养培养 液液+10ml DMSO（12）0.2M pH 7.4 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（13）主要仪器设备：）主要仪器设备：CO2培养箱、超净工作台、倒置培养箱、超净工作

19、台、倒置 显微镜、精密天平、低温和普通冰箱、液氮罐、显微镜、精密天平、低温和普通冰箱、液氮罐、离心机、高压灭菌器、烤箱、水浴锅、除菌滤离心机、高压灭菌器、烤箱、水浴锅、除菌滤 器、酶联免疫测定仪等。器、酶联免疫测定仪等。（14）常规实验器材：血细胞记数板、各种吸管、离心）常规实验器材：血细胞记数板、各种吸管、离心 管、细胞培养瓶、培养皿、管、细胞培养瓶、培养皿、24孔和孔和96孔培养板、孔培养板、细胞冻存管、注射器、微量移液器等。细胞冻存管、注射器、微量移液器等。（15）抗体纯化器材与试剂。）抗体纯化器材与试剂。（16）小鼠实验器材：手术剪刀、镊子等解剖器材。）小鼠实验器材：手术剪刀、镊子等解

20、剖器材。（17）骨髓瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞系）骨髓瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0或或NS-1。第十五页，讲稿共三十页哦3.实验流程实验流程（1）实验动物免疫：）实验动物免疫：BALB/c小鼠，雌性，小鼠，雌性，68W。常规免疫方案：常规免疫方案：0、15、30天，天，72 h后制备脾细后制备脾细 胞悬液。胞悬液。基础免疫：基础免疫：10100 g抗原抗原(可溶性抗原可溶性抗原)完全佐剂完全佐剂 0.2ml(1:1V/V)，背部皮下多点注射。，背部皮下多点注射。加强免疫：同量抗原不完全佐剂，间隔加强免疫：同量抗原不完全佐剂，间隔710天一天一 次。约次。约23次，皮下或腹腔注射。次，皮下或腹

21、腔注射。试试 血：取静脉血，血：取静脉血，ELISA法检测血清中抗体滴度，法检测血清中抗体滴度，当效价达到当效价达到 1：400以上时，进行加强免疫。以上时，进行加强免疫。弱免疫原免疫方案：弱免疫原免疫方案：0天、天、30天、天、45天、天、60天、天、75天。天。第十六页，讲稿共三十页哦（2）免疫动物脾细胞悬液的制备）免疫动物脾细胞悬液的制备：将末次免疫后将末次免疫后3天天BALB/c小鼠处死，消毒，无菌取出小鼠处死，消毒，无菌取出脾脏，置入无菌脾脏，置入无菌PBS或培养液中。在或培养液中。在100目的钢网上研磨脾目的钢网上研磨脾脏。收集细胞于脏。收集细胞于50ml离心管中，离心管中，150

22、0rpm离心离心5分，去上清。分，去上清。加入加入10ml PBS用吸管轻微混匀，用吸管轻微混匀，1500rpm离心离心5分，去上清，分，去上清，用用10ml RPMI培养液悬浮。培养液悬浮。细胞计数（细胞数细胞计数（细胞数/ml=N/4 104 稀释倍数）稀释倍数）用用1640培养液调整细胞浓度至培养液调整细胞浓度至1 108/ml 第十七页，讲稿共三十页哦（3 3）饲养细胞制备）饲养细胞制备 在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞

23、称饲养细胞。常用的是小鼠腹腔巨噬细胞细胞称饲养细胞。常用的是小鼠腹腔巨噬细胞。将正常将正常BALB/cBALB/c小鼠腹部消毒后，注射预冷的无血清培小鼠腹部消毒后，注射预冷的无血清培养液养液5ml5ml，轻揉腹部数次，于腹部左下处剪开腹膜，吸取，轻揉腹部数次，于腹部左下处剪开腹膜，吸取细胞悬液，反复细胞悬液，反复2 23 3次，用培养液离心洗涤次，用培养液离心洗涤2 2次。用次。用15%FCS-RPMI-164015%FCS-RPMI-1640调细胞浓度为调细胞浓度为2 2 10105 5/ml/ml，将细胞接种于，将细胞接种于9696孔培养板，孔培养板，100100 l/l/孔。孔。第十八页

24、，讲稿共三十页哦（4 4）骨髓瘤细胞的准备）骨髓瘤细胞的准备 复苏骨髓瘤细胞用复苏骨髓瘤细胞用1010FCS-RPMI-1640FCS-RPMI-1640培养液培养培养液培养1 1周，周，2 23 3天换液一次，依细胞生长情况天换液一次，依细胞生长情况3 34 4天传代一次，适宜天传代一次，适宜密度密度3103105 5/ml/ml。融合之前。融合之前3 3天，每天换一半培养液，使细天，每天换一半培养液，使细胞保持在对数生长期。取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无胞保持在对数生长期。取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗血清培养液洗2 2次，次，调细胞浓度为调细胞浓度为12 107/ml备用。备

25、用。第十九页，讲稿共三十页哦（5 5 5 5）细胞融合）细胞融合）细胞融合）细胞融合1 1）将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按）将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按1 1：1010或或1 1：5 5 5 5的比例混的比例混的比例混的比例混 合，在合，在50ml50ml离心管中用无血清培养液洗离心管中用无血清培养液洗离心管中用无血清培养液洗离心管中用无血清培养液洗1 1次，离心次，离心次，离心次，离心 弃上清；弃上清；2 2 2 2）1min1min内加入内加入内加入内加入3737预温的预温的1ml 501ml 50PEGPEG溶液，边加边溶液，边加边 摇摇摇摇37373737水浴水浴水浴水浴1min1min；3 3

26、 3 3）加）加）加）加37373737预温的不完全培养液以终止预温的不完全培养液以终止预温的不完全培养液以终止预温的不完全培养液以终止PEGPEGPEGPEG作用，每隔作用，每隔 2min2min2min2min分别加入分别加入1ml1ml1ml1ml、2ml2ml、3ml3ml、4ml4ml、5ml5ml5ml5ml和和6ml6ml6ml6ml；4 4）离心，弃上清，用含）离心，弃上清，用含2020小牛血清小牛血清HATHATHATHAT选择培养液选择培养液选择培养液选择培养液 重悬；重悬；重悬；重悬；5 5）将上述细胞加入已有饲养细胞的）将上述细胞加入已有饲养细胞的96969696孔培养

27、板内，孔培养板内，每孔每孔100100100100 l l，放入放入37 537 5COCO2 2 2 2培养箱培养。培养箱培养。培养箱培养。培养箱培养。第二十页，讲稿共三十页哦（6）融合细胞观察、换液及杂交瘤抗体检测）融合细胞观察、换液及杂交瘤抗体检测 细胞培养细胞培养3天后，使用天后，使用HAT培养液换液；培养液换液；3天后，再次使天后，再次使用用HAT培养液换液。培养液换液。当细胞克隆集落大于当细胞克隆集落大于3mm时，利用间接时，利用间接ELISA法筛选分泌法筛选分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆。单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆。第二十一页，讲稿共三十页哦（7）杂交瘤细胞克隆化）杂交瘤

28、细胞克隆化 将分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞克隆按有限稀释将分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞克隆按有限稀释法稀释细胞（用法稀释细胞（用HAT培养液稀释细胞），于培养液稀释细胞），于96孔培养板中加入孔培养板中加入0.1ml/孔，培养孔，培养2周，利用间接周，利用间接ELISA法挑选单个阳性杂交法挑选单个阳性杂交瘤细胞克隆孔并再次进行亚克隆，直至亚克隆时全部克瘤细胞克隆孔并再次进行亚克隆，直至亚克隆时全部克隆孔细胞培养上清中抗体检出阳性率为隆孔细胞培养上清中抗体检出阳性率为100%为止。为止。第二十二页，讲稿共三十页哦（8）杂交瘤细胞冻存与复苏）杂交瘤细胞冻存与复苏 将阳性细胞克隆在培养板或培养瓶

29、中扩大培养，将阳性细胞克隆在培养板或培养瓶中扩大培养，收集细胞，离心收集细胞，离心1000转、转、5分，弃上清，加入细胞冻存分，弃上清，加入细胞冻存液，移至冻存管，液，移至冻存管，-70冰箱过夜，然后液氮长期保存。冰箱过夜，然后液氮长期保存。将冻存管从液氮中取出，立即放入将冻存管从液氮中取出，立即放入37水浴中，水浴中，使之迅速融化。用培养液洗涤使之迅速融化。用培养液洗涤1次后，加入培养液继续次后，加入培养液继续培养。培养。第二十三页，讲稿共三十页哦（9）单克隆抗体的大量制备）单克隆抗体的大量制备 BALB/c雌性小鼠接种杂交瘤细胞前雌性小鼠接种杂交瘤细胞前12周，腹腔注射降植周，腹腔注射降植

30、烷预处理。用无血清培养液洗涤杂交瘤细胞烷预处理。用无血清培养液洗涤杂交瘤细胞23次，调细胞浓次，调细胞浓度度12 106/ml，每只小鼠腹腔注射，每只小鼠腹腔注射0.51ml细胞悬液。待小鼠腹细胞悬液。待小鼠腹部明显膨大时，收集腹水，离心，收集上清，分装，部明显膨大时，收集腹水，离心，收集上清，分装，-80保存。保存。第二十四页，讲稿共三十页哦（10）单克隆抗体纯化）单克隆抗体纯化盐析法盐析法 腹水腹水10ml等量生理盐水混匀，在电磁搅拌下逐滴缓等量生理盐水混匀，在电磁搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸胺慢加入饱和硫酸胺20ml，4放置放置0.5h以上或过夜。离心以上或过夜。离心（3000rpm）30

31、min，弃上清。沉淀加生理盐水，弃上清。沉淀加生理盐水20ml溶解后，溶解后，再次加入饱和硫酸胺再次加入饱和硫酸胺10 ml，4放置放置0.5h或过夜。离心或过夜。离心（3000rpm）30min，弃上清。沉淀加尽量少生理盐水溶解，弃上清。沉淀加尽量少生理盐水溶解，装入透析袋中，用流动自来水透析装入透析袋中，用流动自来水透析40min，再用生理盐水透析，再用生理盐水透析24h，中间换液，中间换液34次，检测无次，检测无NH4离子存在即可。离子存在即可。-20备用。备用。第二十五页，讲稿共三十页哦凝胶柱层析凝胶柱层析 实验原理：实验原理：凝胶本身是多孔的分子筛，在交联剂作用下形成三维空凝胶本身是

32、多孔的分子筛，在交联剂作用下形成三维空间网状结构，蛋白质溶液流经凝胶柱时，根据蛋白质分子量间网状结构，蛋白质溶液流经凝胶柱时，根据蛋白质分子量的大小不同，由大到小洗脱而进行分离。（大分子蛋白质不的大小不同，由大到小洗脱而进行分离。（大分子蛋白质不能进入凝胶粒内部，在胶粒间隙随洗脱液最先流出。而小分能进入凝胶粒内部，在胶粒间隙随洗脱液最先流出。而小分子蛋白质进入胶粒内部洗脱较慢。）子蛋白质进入胶粒内部洗脱较慢。）关键点：关键点：1.装柱切忌有气泡和断层，有断层要重装柱；装柱切忌有气泡和断层，有断层要重装柱；2.加样时缓冲液面恰好在滤纸片上，及时加样避免柱加样时缓冲液面恰好在滤纸片上，及时加样避免

33、柱 干涸，干涸凝胶不能继续使用；干涸，干涸凝胶不能继续使用；3.因操作时间长，宜在因操作时间长，宜在4操作，防止影响免疫球蛋白操作，防止影响免疫球蛋白 活性。活性。第二十六页，讲稿共三十页哦（1111）单克隆抗体免疫学性质检定）单克隆抗体免疫学性质检定 1 1）单克隆抗体特异性测定；）单克隆抗体特异性测定；2 2）单克隆抗体亚类测定；）单克隆抗体亚类测定；3 3）单克隆抗体效价测定；）单克隆抗体效价测定；4 4）亲和力测定；）亲和力测定；5 5）识别抗原表位的识别抗原表位的测定。测定。第二十七页，讲稿共三十页哦第二十八页，讲稿共三十页哦4.单克隆抗体制备的几处要点：单克隆抗体制备的几处要点：1）相对分子量为）相对分子量为4000的的PEG融合效率最高。融合效率最高。2）免疫原性较强的抗原可不用佐剂，但一般可溶性蛋白）免疫原性较强的抗原可不用佐剂，但一般可溶性蛋白 抗原免疫时需要佐剂，并且乳化要充分。一般多采用抗原免疫时需要佐剂，并且乳化要充分。一般多采用 背部多点注射法免疫小鼠背部多点注射法免疫小鼠35只。只。3）选用高质量血清，细胞融合时可不用饲养细胞，但亚）选用高质量血清，细胞融合时可不用饲养细胞，但亚 克隆时应加入饲养细胞。克隆时应加入饲养细胞。第二十九页，讲稿共三十页哦感谢大家观看第三十页，讲稿共三十页哦