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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流单克隆抗体制备方案.精品文档.单克隆抗体制备方案细胞融合前准备一、动物免疫1.1 动物选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫34只小鼠。1.2免疫原制备15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震摇）50g /只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入7mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用
2、注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4保存。100g/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入3mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4保存。150g/只：称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入2mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4保存。200g/只：称取80mg
3、乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入1mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4保存。250g/只：称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入1mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4保存。1.3 实验步骤初次免疫： 50g、100g、150g、200g、250g抗原溶于PBS中，加等体积的福氏完全佐剂（
4、CFA）腹腔和皮下注射。（共25只小鼠，每组5只，两只采用背部皮下注射，共1ml，0.2ml/点，3只采用腹腔注射） 3周后第二次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加福氏不完全佐剂（IFA），腹腔和皮下注射 3周后第三次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加IFA，腹腔和皮下注射，5天后内眦静脉或断尾取血以ELISA间接法测效价 23周后加强免疫：取初次免疫抗原一半的量溶于PBS，静脉或脾内缓慢注射，以免动物发生过敏性休克而死亡。 34天后取脾细胞融合腹腔注射 大鼠、小鼠一般一人即可注射：以左手大拇指与食指执住鼠两耳及头部皮肤，腹部向上，将鼠固定在手掌间，必要时，以左手无名指及小指夹住鼠
5、尾；右手持连有5号针头的注射器，将针头从下腹部朝头方向刺入腹腔，回抽无回血或尿液，表示针头未刺入肝、膀胱等脏器，即可进行注射。 进行腹腔注射时应注意： 1、针头刺入部不宜太近上腹部或太深，以免刺破内脏。 2、针头与腹腔的角度不宜太小，否则容易刺入皮下。 3、用的针头不要太粗，以免药液注射后从注射孔流出。注射后用棉球按一下注射部位。 4、为避免注射后药液从针孔流出，也可在注射时先使针头在皮下向前推一小段距离，然后再刺入腹腔。 皮下注射 皮下注射较简单，一般都取背部及后腿皮下。注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后即进行注射。 注射器针头不易进入，硬进容易折断针头，故给
6、这些动物作皮下注射时不应选背部皮肤。 一般狗、猫多在大腿外侧；豚鼠在后大腿内侧或小腹部；大鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。1.4 注意事项免疫时抗原的剂量应根据其免疫原性制定，若免疫原性较弱，需在50100g基础上增加。商品化的福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。抗原溶液的体积不能大于佐剂的体积，否则很难乳化好。一般首次注射时佐剂和抗原溶液的比例为1:1。佐剂加入抗原后一定要充分混合成乳剂，混合的方法有研磨法和注射器混合法。乳化完全与否的鉴定方法是将一滴乳剂滴入水中，如立即散开，则未乳化好；如保持完整不散开，呈滴状漂在水面则为乳化完全。乳化过的物质放置一段时间出现油水分
7、层也表明未乳化好。测抗体效价的方法有ELISA间接法、免疫双扩散法、环状实验等。用双向免疫法测定时效价达到1：16以上可用于融合实验；用ELISA方法测定时效价达到1：16000后可用于融合。皮下注射给药皮下注射给药是将药液推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时，常规消毒注射部位皮肤，然后将皮肤提起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻，以防止药物外漏。二、脾淋巴细胞1. 试剂4%的台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加
8、少量蒸馏水研磨后，再加蒸馏水至100ml，用滤纸过滤，4保存。使用时需用0.1mol/L的PBS稀释至0.4（w/v），即1ml 4%的台盼蓝加9ml 0.1mol/L的PBS。RPMI-1640培养液10%FCS-1640培养液2. 试验步骤加强免疫3天后摘除眼球放血，收集血清留作抗体检测时的阳性对照。试管静置3060min后，将血块轻轻剥离管壁，3000r/min离心1520min，吸取上清（血清）4冰箱保存备用。脱椎处死小鼠，浸泡于75酒精中消毒1min在超净工作台中用无菌手术剪刀剪开小鼠左侧皮肤，暴露腹膜，打开腹腔，在无菌条件下取出脾脏置于盛有10ml不完全RPMI-1640培养液的平
9、皿中，轻轻洗去脾脏上的红细胞并细心剥去周围结缔组织，于盛有10ml的RPMI-1640培养液的无菌平皿中过不锈钢筛网用注射器针芯研磨脾脏后用玻璃吸管吹打数次制成细胞悬液，移入10ml离心管中。沉降大块的结缔组织，把细胞悬液转移到50ml离心管中以RMPI-1640培养液充满50ml离心管，配平后在室温下以1000r/min离心10min，弃上清用约10ml的新鲜RPMI-1640培养液重悬重复步骤计数活细胞：把细胞悬液稀释到约个/ml，将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。用移液枪取0.9ml细胞悬液和0.1ml浓度0.4的台盼蓝工作液于EP管中，充分混匀中静置12min，不超过5min
10、。如果染色时间太久，细胞将下沉或受损，而且部分活细胞也会着色。用加样器小心混匀细胞悬液后，立即用微量加样器将其加于血球计数板，置于倒置显微镜下观察并计数活细胞和死细胞。死细胞被染成淡蓝色，活细胞排斥台盼兰，不被染色。活细胞数大于80%为合格。3. 注意事项取样计数前应充分混匀细胞悬液。数细胞的原则是只计数完整的细胞，镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。若细胞压在格线上时，只计上侧和左方的。操作时注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2108左右
11、。三、饲养细胞1012周龄Balb/c小鼠脱椎处死，浸泡于75酒精，消毒3min5min用注射器抽取5ml预冷的10%的FCS-1640培养液注射到小鼠腹腔（严禁刺破肠管）并用手指轻揉3min5min后，用无菌剪刀剪开小鼠腹部一小口，用圆头尖吸管吸出并移入50ml离心管中。吸的过程一定不要刺破肠管以免细菌污染。室温1200r/min离心5min6min弃上清液，用10%胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1105个/ml将细胞转入96孔培养板，每孔100l，放入37CO2培养箱中培养.四、骨髓瘤细胞1.骨髓瘤细胞介绍目前应用最多的是Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株SP2/0-Ag14
12、（简称SP2/0）细胞株。骨髓瘤细胞适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。细胞的最大密度不得超106个/ml，一般扩大培养以110稀释传代，每35天传代一次。细胞的倍增时间为1620小时。一般在融合前两周就应该对其进行复苏。SP2/0细胞为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。在细胞融合的前一天用新鲜的10%FCS-1640培养基调整细胞浓度为2.0105个/ml，次日取约11076107对数生长期（即培养15h20h）的骨髓瘤细胞，于室温1000g（3000r/min）离心10min收集沉淀，以无血清RPMI-1640培养液重悬并计数。此时细胞形态良好，观察
13、形态完整，排列整齐，密度为0.11061106个/ml。经胎盼蓝染色活细胞数95%。SP2/0细胞是肿瘤细胞株，一般注射到小鼠体内约1周左右就可以使小鼠致死。在其状态萎靡的时候就可以用基础培养基洗出其腹腔中的细胞，分离SP2/0细胞。整个过程要保证无菌，否则就前功尽弃了。为了防止骨髓瘤细胞（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT缺陷株）变异出现返祖现象，在融合前骨髓瘤细胞株可在含有15g/ml或20g/ml的8氮鸟嘌呤(8-AG)的培养基内适应性培养一周或定期对细胞进行筛选，再转入完全培养基培养12周即可用于融合。8-AG一般试剂公司都有（如Sigma），使用时需仔细看说明，根据根据说明配置相应浓度
14、的8-AG。2.细胞培养每月用新洁尔灭或84消毒液擦拭无菌间的所有所有器件、地板和墙壁一次，进行彻底消毒。一般在实验前用紫外灯照射无菌室3060min，实验做完后再用紫外灯照射30min。配合紫外线灭菌灯使实验室经常保持高度的无菌状态。紫外灯开启时间较长时，可激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子，这种气体分子具有很强的杀菌作用，可以对紫外线没有直接照到的角落产生灭菌效果。由于臭氧有碍健康，在进入操作之前应先关掉紫外线灯，关后十分钟即可进入。实验前开启超净工作台内紫外灯，照射1030min，然后让超净工作台预工作10min15min，以除去臭氧和使工作台面空间呈净化状态。进入无菌培养室原则上应按外科
15、手术进行洗手和着装，即穿戴无菌服、帽子和口罩，并换鞋。用后要清洗消毒备用。开始操作前用75%酒精和0.2%新洁尔灭消毒手和前臂，洗手时要洗刷到肘部。使用过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以75%酒擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。定期检测 CO2钢瓶的压力、CO2 培养箱中CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。使用完毕，用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦
16、拭工作台面和台内四周（切不可用酒精擦拭有机玻璃挡板）。用过的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少许清洗剂，以超声波洗涤30min左右，(如无超声波洗涤器可用软毛刷轻轻刷洗干净)，捞出晾干，再在铬酸洗液中浸泡6-18h(或过夜)后，自来水清洗10-15遍，双蒸水清洗3-4遍，晾干，高压消毒后即可使用。细胞要经常冻存，只要细胞状态好就将细胞冻存起来。生长良好的细胞在倒置显微镜下观察形态完整,圆形明亮,排列整齐,密度为0.11061106个/ml。经台盼蓝染色检测，活细胞数应大于90%95%。3.细胞传代0.25%胰蛋白酶（消化25cm2培养瓶每瓶约需2ml，75cm2培养瓶每瓶约需6ml
17、）：0.25g胰蛋白酶加入100mlD-hanks液中，滤膜过滤除菌，分装4保存。使用时温度在37左右为宜。5ml吸管、Tip头、加样器、培养瓶4.细胞冻存4.1实验器材及试剂4.1.1 10%的DMSO冻存液配方：RPMI-1640培养液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1.0ml，双抗0.1ml，5.6%NaHCO30.1ml。NaHCO3可在超净台内经过滤膜除菌。DMSO在常温下有毒，在配置冻存液时，注意保护自己，带好手套。最好现配现用。4.1.2 冻存管、离心管、0.25%胰酶、0.4%的胎盼蓝工作液、PBS、细胞计数板、计数器、显微镜、-80冰箱、纱布4.2实验步骤选用指数生长期
18、的细胞，已经长满的细胞冻存复苏后存活率低。在冻存前一天最好换一次培养液。悬浮生长的细胞需离心8001000r/min离心5min（选择1000r/min，5min），弃上清。但骨髓瘤细胞绝大部分是贴壁生长，需用胰酶消化35min。消化时间过长会损伤细胞，太短达不到预期效果。用在4冰箱放置3060min的冻存液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度至1106个/ml10106个/ml（选择浓度在5106个/ml）。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每只冻存管加液11.5ml。可用胶带密封。每个冻存管上标明冻存时间、细胞名称、操作者等。此外还应记录每个冻存管中的细胞数量。将冻存管在4 放置30
19、min。将冻存管移入-20冰箱内30min。将细胞转移至-801618小时（或隔夜）。最后匀速下降至液氮中。4.3注意-20不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡。原则上细胞在液氮中可储存多年，但为妥善起见，冻存1年后应再复苏1次，然后再继续冻存。常温下DMSO对细胞有毒副作用，因此应将冻存液在4条件下放置3060min后使用。5.细胞生长曲线5.1 MTT比色实验5.1.1检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞的数量
20、。MTT比色法计数为间接计数，先要作出细胞的标准曲线，然后根据待测样品的A质计算出细胞数。5.1.2试剂及实验器材MTT溶液：一般最好现用现配，称取250mgMTT于小烧杯中，加50mlPBS（0.01mol/L，pH7.4）在电磁搅拌机上搅拌30min，用0.22的微孔滤膜除菌，分装，4保存，两周内有效。保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。含10%胎牛血清RPMI-1640培养液、0.25%胰蛋白酶消化液、DMSO、96孔培养板、10Tip头、酶标仪、振荡混合器、显微镜、离心管制作标准曲线：准备细胞悬液，从1107个/200/孔开始
21、在96孔平板中倍比稀释至102个/200/孔，每个稀释度3个孔。培养板置37培养4h后细胞贴壁，每孔中加入20MTT继续培养4h6h，终止培养，对于悬浮生长的细胞，需离心（1000r/min，5min），然后弃去孔内培养液，每孔加入150DMSO，振荡10min，使甲臜充分溶解。选择490nm波长，以不加细胞只加培养液的孔做空白对照调零，在酶标仪上测各孔吸光度值。制作生长曲线：调整细胞的浓度，按2103个/200/孔接种在96孔板中，约接种10块板，每块板的接种孔数月20个。置37培养，每12h用MTT比色法测定一块板中细胞的A值，在标准曲线上计算出相应的细胞数，即可以时间轴为横轴，光吸收值（
22、A）为纵轴绘制出细胞的生长曲线。注意避免血清的干扰，用含15%的胎牛血清培养液培养细胞时，高浓度的血清物质会影响试验孔的光吸收值，使实验本底值增高。一般选用小于10%胎牛血清的培养液进行试验。呈色后尽量吸净培养孔的培养液。5.2 细胞计数法 细胞培养瓶30个、台盼蓝、计数器、显微镜、计数板、盖玻片收集细胞，胎盼蓝染色计数，调整浓度为104/ml，在每个细胞培养瓶中加入7ml，每过12h用台盼蓝计数其中的细胞数。SP2/0虽为半悬浮生长，但悬浮细胞多为死细胞或状态不好的细胞，每23天可吸掉培养液并加入等体积的培养液。吹打前用右手紧握培养瓶使其平放在手心，右手从右侧拍击培养瓶壁45次，不要让培养瓶
23、晃动剧烈而形成泡沫。 6.细胞复苏 将超声机设为加热至40并等到温度到达再开始复苏过程、15ml离心管、RPMI-1640培养液、含10%胎牛血清的1640培养液、CO2培养箱、Tip头、低速离心机培养液在恒温水浴箱37预热20min，备用。从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。将细胞悬液移入15ml离心管，加入10倍以上基础培养液，离心（1000r/min，5min）。倒净上清后加入含10%胎牛血清的培养液悬液混悬沉淀细胞，加入培养瓶中，调整细胞浓度至105个/ml，CO2培养箱中培养。记录复苏日期。次日更换培养液，继续培养【注意事项】1.取细胞的过程中
24、注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。2.DMSO对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。DMSO最好选择进口产品。3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后DMSO浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。4.DMSO的浓度在小于0.5%时对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1。所以10的冻存液加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。五、细胞融合，选择杂交瘤用作细胞融合剂的聚乙二醇（PEG）一般
25、选用相对分子量为4000者，该分子量的PEG呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起反应。常用浓度为50，pH值7.48.0（用10NaHCO3调整）。通常选用供气相色谱用的高纯度PEG做融合剂。融合前一天换新鲜培养液一次，次日用弯头吸管轻轻吹下贴壁生长的处于对数生长期的SP2/0细胞，用无血清的RPMI-1640培养液洗3次（800r/min离心5min），再重悬于5ml无血清RPMI-1640培养液中，计数活细胞，置冰上备用。1.试剂及实验器材不加血清的RPMI-1640、离心管（50ml的约50个）、10ml吸管（约10支）、无菌棉签（约一包）、5
26、0%的PEG（分子量4000，pH值7.48.0，约50ml）、HAT、HT、胎牛血清、24孔培养板（约50块）、Tip头（约100个）、较大的滤膜（约5个）2.实验步骤将脾细胞与骨髓瘤细胞按101（108个脾细胞和107个小鼠骨髓瘤细胞）的比例在50ml离心管内混合，加50ml无血清RPMI-1640培养液。室温1200r/min离心8min。同法洗涤混合细胞2次。小心吸出上清，颠倒离心管使管口向下，用无菌棉球吸净残留液体以避免稀释PEG。轻敲离心管底部，使细胞沉淀略加松动，置离心管于水浴中，使其达到37加入37下预温的0.8ml或者0.7ml 50%的聚乙二醇（PEG），边加边摇晃离心管，
27、此时肉眼可见有颗粒出现，滴加过程要求持续60s，37静置90s在5min内加入20ml 37预温的无血清RPMI-1640培养液以终止融合剂的作用，即第1min内加入1ml，第2min内加入2ml，后3min内加入17ml，边滴加边摇动。室温800r/min离心7min沉淀细胞弃上清，轻敲离心管底部，加25ml含20%小牛血清的HAT培养液。HAT（50）用时取10ml加入490ml10FCS-1640培养液中。 加到已有饲养细胞层的24孔板内，每孔加0.5ml。放入5%CO2饱和湿度的37培养箱中培育 第4天后更换HAT培养液（轻轻吸上清液，切勿吸出固定于孔底的细胞，补加一些液体至一定的高度
28、，根据需要加入适量的饲养细胞） 第14、16日加入HT培养液。HT培养液（100）在用取5ml加495ml10%FCS-1640培养液中过滤除菌，分装保存。在每次换液前用倒置显微镜观察细胞生长状况，杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体，及早液氮冻存备份和克隆化。3.注意事项 在10天左右可观察到大而明亮、立体感强的杂交瘤细胞大多数杂交瘤细胞在1020天出现，但也有在1个月左右才能出现的。而且每个细胞群落明显。 融合实验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境以及适宜的无菌操作技术。 融合的关键除了无菌操作之外就是动作一定要轻柔，而且一定要混匀不然在镜下会出现成团的细胞，影响本
29、就不高的融合率。 融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素1.PEG有毒性或作用时间过长。2.牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。3.骨髓瘤细胞污染了支原体。4.HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。 杂交瘤的选择：当细胞集落面积超过培养孔的1/10以上时，即可检测抗体阳性孔，连续三次检测逐渐升高或维持在同一水平者，则可以做克隆化，一部分则冷藏起来长期保种用。六、抗体检测（ELISA间接法）1.实验仪器 酶联免疫检测仪，洗板机，聚乙烯96孔微量反应板，微量加样器，1.5ml离心管。2.实验试剂 1. 包被用抗原：转基因的人乳铁蛋白和-LA2. 酶标抗抗体
30、（酶标二抗）：兔抗小鼠IgG-HRP或兔抗鼠IgM-HRP3. 包被液（碳酸盐缓冲液pH9.5）：Na2CO3 1.59g，NaHCO32.93g，加800ml水溶解，定容至1000ml加0.02%的NaN3，0.22膜过滤，4保存4. 洗涤缓冲液（0.01mol/LpH7.4的PBS-T）：pH7.4的PBS：在1000ml蒸馏水中溶解Nacl 8.0g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4 1.1g，KCl 0.2g，以HCl或NaOH调节pH至7.4，高压下灭菌20min，保存于室温。取0.5ml0.05%的Tween20与1000mlPBS配制成洗涤缓冲液5. TMB 底物溶液：称取
31、固体TMB 溶于DMSO 配成1mg/mlTMB溶液， 4避光保存。用前要检查其状态，若有凝固，可用手温将其融化。底物缓冲液（pH5.0）： 柠檬酸1.02g ，NaHPO4.12H2O 3.68g溶于100ml 水中。4避光保存的30 H2O2。使用前按TMB：底物缓冲液：H2O2为100：900：1配置，如底物缓冲液9ml加TMB溶液 1ml加10l 30%H2O2 (即配即用)6. 封闭液：10%的小牛血清（1ml小牛血清加到9ml1PBS中混匀 ）7. 终止液：2mol/LH2SO43.实验步骤包被：用0.05mol/L的碳酸盐包被缓冲液（pH值9.5）将抗原稀释至8g/ml，每个聚乙
32、烯微量反应板的孔中加100l，4过夜。次日倾去凹孔内的液体，用洗涤液洗35次。封闭：加入10%的小牛血清封闭液200l，37孵育12h，用洗涤液洗35次加样：加一定稀释的待检样品（未知抗体）100l于上述已包被之反应孔中，置37孵育12h，洗涤，同时做空白、阴性及阳性孔对照加酶标抗体：加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）100l，37孵育12h，用洗涤液洗涤，最后一遍用双蒸水（DDW）洗涤加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100l，37孵育2030min终止反应：于各反应孔中加入2mol/L硫酸50l结果判定：若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观
33、察结果。也可在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。七、杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）在96孔细胞培养板中每孔依次加入100l饲养细胞液（约含1.0105个腹腔细胞）制备待克隆的杂交瘤细胞悬液：用含10%血清的HT培养基稀释至10个细胞/ml，每孔接种量为0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。37、5% CO2培养710天，出现肉眼可见的克隆或者在倒置显微镜下能够观察到杂交瘤细胞布满孔底1/3面积即可检测抗体；标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。取抗体检测阳性孔消化分离细胞，并转种于24孔板中扩大培养。并冻
34、存。注意事项：在显微镜下确定培养孔中的细胞数时，应特别注意观察孔的周边，细胞折光弱，不易观察，最好两个人进行确认。克隆的时间一般越早越好，但不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时间培养后，还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆培养。克隆化的次数多少由分泌能力强弱和抗原的免疫强弱而决定，一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要35次克隆才能稳定。八、杂交瘤细胞的冻存选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好更换新鲜的10%FCS-1640培养液除去细胞培养瓶中培养液，加入新鲜的10%FCS-164
35、0培养液，用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打贴附在瓶壁上的细胞，使细胞均匀分散悬浮1000r/min离心10min，弃上清液。细胞沉淀用10%二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0107细胞/ml取样，用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002000个/毫升，和0.4的胎盘蓝溶液按1:1轻轻混合后，用移液枪点样到血球计数板，置于倒置显微镜下观察，计数，因活细胞排斥台盼兰，不被染色，其中蓝色细胞是死细胞。存活率应在95%以上 分装冷冻管，冷冻管要将盖子盖紧，每瓶0.51ml，在酒精灯上封口冷冻管 置4冰箱2h 将有布袋包裹的冷冻管移入液氮罐气态部分（-70）暂放15h，最后沉入液氮中（-195）九、单克隆
36、抗体的生产及纯化1.动物体内生产单抗成年Balb/c小鼠（5月龄）腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.30.5ml，7天后使用收集对数生长期的杂交瘤细胞，用生理盐水洗涤两次，1500r/min离心10min取样，用胎盘蓝染色，计数活细胞，重新用生理盐水配制成5106个细胞/ml的悬液给每只小鼠腹腔注射0.5ml处于对数生长期的杂交瘤细胞间隔5天后，每天观察小鼠腹水的产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用针头抽提腹水，一般可连续收集23次，通常每只小鼠可收集510ml腹水，其单克隆的量可达到510mg/ml2000r/min离心腹水5min，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集
37、上清，测定抗体效价，分装-70冻存备用。2.单克隆抗体的纯化（饱和硫酸铵盐析沉淀法）2.1实验材料及试剂2.1.1 生理盐水：0.9gNaCl溶于100ml蒸馏水中，高压灭菌2.1.2 0.01mol/LpH7.4PBS：在1000ml蒸馏水中溶解Nacl 8.0g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4 1.1g，KCl 0.2g，以HCl或NaOH调节pH至7.4，高压下灭菌20min，保存于室温。2.1.3. 饱和硫酸铵（SAS）溶液：称取400g硫酸铵溶于500ml蒸馏水，加热到7080，搅拌使大部分晶体溶解，室温静置过夜，可见部分硫酸铵结晶析出，沉于瓶底，上清即位饱和硫酸铵溶液。pH
38、约为5，以28%氨水调pH值至7.2.过滤备用2.1.4. 磁力搅拌袋，透析袋2.2实验步骤腹水4 12000r/min离心15min，去除杂质。取20ml样品上清，与等体积生理盐水混合均匀，边搅拌边缓慢滴加40ml饱和硫酸铵（SAS；体积分数为50%），用浓氨水调至pH值8.0，转入4搅拌30min以上。 室温平衡后，于20000g离心10分钟，弃上清；用40ml生理盐水溶解沉淀，同步骤，搅拌滴加20mlSAS，调pH值，转入4搅拌30min以上重复步骤23次最后一次离心后所得沉淀物即为粗提抗体。将此沉淀物溶于45生理盐水中，装入透析袋透析，置于4对200倍体积的PBS搅拌透析，至少更换3次
39、外液。收集透析袋内抗体溶液，离心取上清，测定抗体的纯度，于4或-20保存小鼠免疫程序一、抗原的准备1、收到抗原时，首先要了解抗原的种类、性质和浓度，以便采取不同的处理方法。2、多肽抗原，一般分多肽偶联KLH和多肽偶联BSA（或GGG）或裸多肽三种。多肽偶联KLH一般用于免疫，而多肽偶联BSA或裸肽一般用于检测，在免疫时注意区分使用。3、分装（1）收到抗原后，应及时按免疫需要分装，避免反复冻融。（2）如抗原是大肠杆菌重组蛋白，可能存在不溶性沉淀，分装前，应用超声粉碎仪粉碎，要注意，在冰浴中进行，超声强度应以溶液不产生泡沫的水平为准，超声强度过大，易产生泡沫导致蛋白变性，超声强度太低效果不佳，每次
40、2-3秒，重复3-4次，超声完毕立即分装。（3）分装管应用不粘附蛋白的样品管，要用二种不同颜色的标签明确区分免疫用抗原和检测用抗原，并写明分装日期，抗原名，浓度和剂量。A 免疫用抗原：一般50ug/每只小鼠5只=250ug/1个分装管，备做首次免疫用。另分装2个100ug/1管，备做融合前加强免疫用，再分装25ug/只/5=125ug/1个分装管，共分装4-5管，备加强免疫用。B 检测用抗原：100ug/每管，分装共3管。C 分装好的抗原除马上免疫用管外，其余均装入小塑料袋中，写好抗原名标签，马上存入-700C。剩余抗原交保管员存-700C，并填好交接班表格。二、免疫程序1、多肽类抗原（包括M
41、AP型多肽），第一次用福氏完全佐剂，每只50-100ug ,腹腔注射，总剂量0.5ml/只，第二次起用福氏不完全佐剂，剂量为25-50ug/0.5ml/只，间隔3周，第三次注射后10天测血（ELISA法），如滴度未达到1:104, OD1.0以上，则继续免疫，如ELISA已达滴度，则可取血清送WB或ICC检测。2、蛋白类抗原：所用抗原的剂量等与多肽类相同，但进程有差异，首次免疫21天后，第二次免疫后，每次间隔为10天。三、抗原的乳化抗原乳化前，应检查抗原管有否颗粒状沉淀，如有沉淀，应超声粉碎后，立即溶解在0.01M PH7.2 PBS中（PBS应为无菌液），每只小鼠腹腔注射总量0.5ml，用2-5ml注射器，取1.25ml含抗原的PBS，另一支注射器取（等体积）福氏完全佐剂或不完全佐剂，用不锈钢连接接头连接，反复推拉混合约10-30分钟，平放静置30分钟，如水乳相不再分离，即可注射小鼠。