单克隆抗体制备.ppt

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1、现在学习的是第1页，共30页免疫血清和单克隆抗体的制备免疫血清和单克隆抗体的制备现在学习的是第2页，共30页一、免疫血清的制备一、免疫血清的制备1. 原理：原理： 机体具有多种机体具有多种B细胞克隆，细胞克隆，将适当的抗原物质注入人或动物将适当的抗原物质注入人或动物体内体内后可被不同的后可被不同的B细胞克隆同时识别，细胞克隆同时识别，经过一定时间，经过一定时间，受受刺激的刺激的B细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相应的特异性细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相应的特异性抗体，每一抗原表位都能诱发相应抗体，每一抗原表位都能诱发相应B细胞克隆产生单克隆抗细胞克隆产生单克隆抗体，此获得的血清即为含多种单

2、克隆抗体的混合物，称之体，此获得的血清即为含多种单克隆抗体的混合物，称之为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。 优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。现在学习的是第3页，共30页现在学习的是第4页，共30页4. 抗原的处理抗原的处理1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬

3、液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数剂，直接免疫。菌体数11010个个/ml 为宜。为宜。2）可溶性蛋白质抗原（如人）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂 （1：1 V/V）混合、乳化。）混合、乳化。3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载 体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥）、钥 孔嘁血蓝素孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。

4、有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联 剂。剂。现在学习的是第5页，共30页现在学习的是第6页，共30页3. 弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂 1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡）配方：羊毛脂：液体石蜡 为为1：2，也可，也可1：1。 灭活卡介苗灭活卡介苗（2 2 20mg/ml20mg/ml）。）。4. 弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐 剂。剂。5. 用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳

5、化。用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳化。现在学习的是第7页，共30页现在学习的是第8页，共30页现在学习的是第9页，共30页2. 可溶性抗原免疫可溶性抗原免疫 1）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行 加强免疫，以后每隔加强免疫，以后每隔2周加强免疫一次。周加强免疫一次。 2）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、 小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验 测定血清效价测定血清效价1：32或或ELISA法测定抗体效价法测定抗体效价 1：10 000，表明

6、抗体效价较高，可采兔颈动脉，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉 或心脏全部血液，分离血清。或心脏全部血液，分离血清。 4）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需45 次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免 疫。疫。 3. 颗粒性抗原免疫颗粒性抗原免疫 第一周注射第一周注射2次，随后每周加强免疫次，随后每周加强免疫1次，次，45天天 试血。试血。现在学习的是第10页，共30页3. 操作程序操作程序 1）健康雄性家兔体重）健康雄性家兔体重2.5 3 kg，背部皮下多点注射。，背部皮下多点注射。2）基础免疫：抗原完全佐剂）

7、基础免疫：抗原完全佐剂 (抗原剂量抗原剂量4mg/只只) 2ml (1:1V/V) 吸入两支注射器内，三通连接，吸入两支注射器内，三通连接， 反复推拉混合至乳化悬液。反复推拉混合至乳化悬液。3）加强免疫：抗原不完全佐剂）加强免疫：抗原不完全佐剂 (抗原剂量抗原剂量2.5mg/只只)， 间隔间隔710天加强一次。约天加强一次。约23次。次。4）试）试 血：末次注射后第血：末次注射后第7天取少量静脉血，免疫双天取少量静脉血，免疫双 扩试验血清检测，抗血清效价扩试验血清检测，抗血清效价 1：32（或（或 ELISA法检测抗体效价法检测抗体效价1：10，000）时颈）时颈 动脉放血，分离血清，分装，保

8、存。动脉放血，分离血清，分装，保存。现在学习的是第11页，共30页二二 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 1975年年 Kohler和和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学的研究进抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪元。入了一个高度准确的新纪元。现在学习的是第12页，共30页现在学习的是第13页，共30页

9、 2. 试剂与器材试剂与器材（1）细胞融合剂：聚乙二醇（）细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）（2）0.2mol/L L-谷氨酰胺贮存液谷氨酰胺贮存液（3）200 双抗（青、链霉素）溶液双抗（青、链霉素）溶液（4）RPMI-1640培养液培养液（5）15%胎牛血清胎牛血清RPMI-1640培养液培养液（6）100 氨基蝶呤（氨基蝶呤（A）贮存液）贮存液（7）100 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（8）1 HAT培养液培养液（9）1 HT培养液培养液（10）100 8-杂氮鸟嘌呤贮存液杂氮鸟嘌呤贮存液现在学习的是第14页，共30页（11）细胞冻存液：）细胞冻存液：90ml含含

10、30%FCS的的RPMI-1640培养培养 液液+10ml DMSO （12）0.2M pH 7.4 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（13）主要仪器设备：）主要仪器设备：CO2培养箱、超净工作台、倒置培养箱、超净工作台、倒置 显微镜、精密天平、低温和普通冰箱、液氮罐、显微镜、精密天平、低温和普通冰箱、液氮罐、 离心机、高压灭菌器、烤箱、水浴锅、除菌滤离心机、高压灭菌器、烤箱、水浴锅、除菌滤 器、酶联免疫测定仪等。器、酶联免疫测定仪等。（14）常规实验器材：血细胞记数板、各种吸管、离心）常规实验器材：血细胞记数板、各种吸管、离心 管、细胞培养瓶、培养皿、管、细胞培养瓶、培养皿、24孔和孔和96孔培养板

11、、孔培养板、 细胞冻存管、注射器、微量移液器等。细胞冻存管、注射器、微量移液器等。（15）抗体纯化器材与试剂。）抗体纯化器材与试剂。（16）小鼠实验器材：手术剪刀、镊子等解剖器材。）小鼠实验器材：手术剪刀、镊子等解剖器材。（17）骨髓瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞系）骨髓瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0或或NS-1。现在学习的是第15页，共30页3. 实验流程实验流程（1）实验动物免疫：）实验动物免疫：BALB/c小鼠，雌性，小鼠，雌性，68W。 常规免疫方案：常规免疫方案：0、15、30天，天，72 h后制备脾细后制备脾细 胞悬液。胞悬液。基础免疫：基础免疫：10100 g抗原抗原 (可溶性抗原可

12、溶性抗原)完全佐剂完全佐剂 0.2ml (1:1V/V) ，背部皮下多点注射。，背部皮下多点注射。加强免疫：同量抗原不完全佐剂，间隔加强免疫：同量抗原不完全佐剂，间隔710天一天一 次。约次。约23次，皮下或腹腔注射。次，皮下或腹腔注射。 试试 血：取静脉血，血：取静脉血，ELISA法检测血清中抗体滴度，法检测血清中抗体滴度， 当效价达到当效价达到 1：400以上时，进行加强免疫。以上时，进行加强免疫。 弱免疫原免疫方案：弱免疫原免疫方案：0天、天、30天、天、45天、天、60天、天、75天。天。现在学习的是第16页，共30页（2）免疫动物脾细胞悬液的制备）免疫动物脾细胞悬液的制备 ： 将末次

13、免疫后将末次免疫后3天天BALB/c小鼠处死，消毒，无菌取出脾小鼠处死，消毒，无菌取出脾脏，置入无菌脏，置入无菌PBS或培养液中。在或培养液中。在100目的钢网上研磨脾脏目的钢网上研磨脾脏。收集细胞于。收集细胞于50ml离心管中，离心管中，1500rpm离心离心5分，去上清。分，去上清。加入加入10ml PBS用吸管轻微混匀，用吸管轻微混匀，1500rpm离心离心5分，去上清，分，去上清，用用10ml RPMI培养液悬浮。培养液悬浮。 细胞计数（细胞数细胞计数（细胞数/ml=N/4 104 稀释倍数）稀释倍数） 用用1640培养液调整细胞浓度至培养液调整细胞浓度至1 108 /ml 现在学习的

14、是第17页，共30页（3 3）饲养细胞制备）饲养细胞制备 在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞称加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。常用的是小鼠腹腔巨噬细胞饲养细胞。常用的是小鼠腹腔巨噬细胞。 将正常将正常BALB/cBALB/c小鼠腹部消毒后，注射预冷的无血清培小鼠腹部消毒后，注射预冷的无血清培养液养液5ml5ml，轻揉腹部数次，于腹部左下处剪开腹膜，吸取细，轻揉腹部数次，于腹部左下处剪开腹膜，吸取细胞悬液，反复胞悬液，反复2 23 3次，用培养液离

15、心洗涤次，用培养液离心洗涤2 2次。用次。用15%FCS-15%FCS-RPMI-1640RPMI-1640调细胞浓度为调细胞浓度为2 2 10105 5/ml/ml，将细胞接种于，将细胞接种于9696孔培养孔培养板，板，100100 l/l/孔。孔。 现在学习的是第18页，共30页（4 4）骨髓瘤细胞的准备）骨髓瘤细胞的准备 复苏骨髓瘤细胞用复苏骨髓瘤细胞用1010FCS-RPMI-1640FCS-RPMI-1640培养液培养培养液培养1 1周周，2 23 3天换液一次，依细胞生长情况天换液一次，依细胞生长情况3 34 4天传代一次，适宜天传代一次，适宜密度密度3 310105 5/ml/m

16、l。融合之前。融合之前3 3天，每天换一半培养液，使细胞天，每天换一半培养液，使细胞保持在对数生长期。取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培保持在对数生长期。取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗养液洗2 2次，次，调细胞浓度为调细胞浓度为12 107 / ml备用。备用。 现在学习的是第19页，共30页现在学习的是第20页，共30页（6）融合细胞观察、换液及杂交瘤抗体检测）融合细胞观察、换液及杂交瘤抗体检测 细胞培养细胞培养3天后，使用天后，使用HAT培养液换液；培养液换液；3天后，再次使天后，再次使用用HAT培养液换液。培养液换液。 当细胞克隆集落大于当细胞克隆集落大于3mm时，利用间接

17、时，利用间接ELISA法筛选分泌法筛选分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆。单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆。现在学习的是第21页，共30页（7）杂交瘤细胞克隆化）杂交瘤细胞克隆化 将分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞克隆按有限稀将分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞克隆按有限稀释法稀释细胞（用释法稀释细胞（用HAT培养液稀释细胞），于培养液稀释细胞），于96孔培养板孔培养板中加入中加入0.1ml/孔，培养孔，培养2周，利用间接周，利用间接ELISA法挑选单个阳性法挑选单个阳性杂交瘤细胞克隆孔并再次进行亚克隆，直至亚克隆时全部克杂交瘤细胞克隆孔并再次进行亚克隆，直至亚克隆时全部克隆孔细胞培养上清中抗体检出阳

18、性率为隆孔细胞培养上清中抗体检出阳性率为100%为止。为止。现在学习的是第22页，共30页（8）杂交瘤细胞冻存与复苏）杂交瘤细胞冻存与复苏 将阳性细胞克隆在培养板或培养瓶中扩大培养，将阳性细胞克隆在培养板或培养瓶中扩大培养，收集细胞，离心收集细胞，离心1000转、转、5分，弃上清，加入细胞冻存分，弃上清，加入细胞冻存液，移至冻存管，液，移至冻存管，-70冰箱过夜，然后液氮长期保存。冰箱过夜，然后液氮长期保存。 将冻存管从液氮中取出，立即放入将冻存管从液氮中取出，立即放入37水浴中，水浴中，使之迅速融化。用培养液洗涤使之迅速融化。用培养液洗涤1次后，加入培养液继续次后，加入培养液继续培养。培养。

19、现在学习的是第23页，共30页（9）单克隆抗体的大量制备）单克隆抗体的大量制备 BALB/c雌性小鼠接种杂交瘤细胞前雌性小鼠接种杂交瘤细胞前12周，腹腔注射降植周，腹腔注射降植烷预处理。用无血清培养液洗涤杂交瘤细胞烷预处理。用无血清培养液洗涤杂交瘤细胞23次，调细胞浓度次，调细胞浓度12 106/ml，每只小鼠腹腔注射，每只小鼠腹腔注射0.51ml细胞悬液。待小鼠腹细胞悬液。待小鼠腹部明显膨大时，收集腹水，离心，收集上清，分装，部明显膨大时，收集腹水，离心，收集上清，分装，-80保保存。存。现在学习的是第24页，共30页（10）单克隆抗体纯化）单克隆抗体纯化盐析法盐析法 腹水腹水10ml等量生

20、理盐水混匀，在电磁搅拌下逐滴缓慢等量生理盐水混匀，在电磁搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸胺加入饱和硫酸胺20ml，4放置放置0.5h以上或过夜。离心（以上或过夜。离心（3000rpm）30min，弃上清。沉淀加生理盐水，弃上清。沉淀加生理盐水20ml溶解后，溶解后，再次加入饱和硫酸胺再次加入饱和硫酸胺10 ml，4放置放置0.5h或过夜。离心（或过夜。离心（3000rpm）30min，弃上清。沉淀加尽量少生理盐水溶解，弃上清。沉淀加尽量少生理盐水溶解，装入透析袋中，用流动自来水透析装入透析袋中，用流动自来水透析40min，再用生理盐水透，再用生理盐水透析析24h，中间换液，中间换液34次，检测无次，

21、检测无NH4离子存在即可。离子存在即可。-20备用。备用。现在学习的是第25页，共30页凝胶柱层析凝胶柱层析 实验原理：实验原理： 凝胶本身是多孔的分子筛，在交联剂作用下形成三维空凝胶本身是多孔的分子筛，在交联剂作用下形成三维空间网状结构，蛋白质溶液流经凝胶柱时，根据蛋白质分子量间网状结构，蛋白质溶液流经凝胶柱时，根据蛋白质分子量的大小不同，由大到小洗脱而进行分离。（大分子蛋白质不的大小不同，由大到小洗脱而进行分离。（大分子蛋白质不能进入凝胶粒内部，在胶粒间隙随洗脱液最先流出。而小分能进入凝胶粒内部，在胶粒间隙随洗脱液最先流出。而小分子蛋白质进入胶粒内部洗脱较慢。）子蛋白质进入胶粒内部洗脱较慢

22、。） 关键点：关键点：1. 装柱切忌有气泡和断层，有断层要重装柱；装柱切忌有气泡和断层，有断层要重装柱；2. 加样时缓冲液面恰好在滤纸片上，及时加样避免柱加样时缓冲液面恰好在滤纸片上，及时加样避免柱 干涸，干涸凝胶不能继续使用；干涸，干涸凝胶不能继续使用；3. 因操作时间长，宜在因操作时间长，宜在4操作，防止影响免疫球蛋白操作，防止影响免疫球蛋白 活性。活性。现在学习的是第26页，共30页（1111）单克隆抗体免疫学性质检定）单克隆抗体免疫学性质检定 1 1）单克隆抗体特异性测定；）单克隆抗体特异性测定； 2 2）单克隆抗体亚类测定；）单克隆抗体亚类测定； 3 3）单克隆抗体效价测定；）单克隆

23、抗体效价测定； 4 4）亲和力测定；）亲和力测定； 5 5）识别抗原表位的识别抗原表位的测定。测定。现在学习的是第27页，共30页现在学习的是第28页，共30页4. 单克隆抗体制备的几处要点：单克隆抗体制备的几处要点：1）相对分子量为）相对分子量为4000的的PEG融合效率最高。融合效率最高。2）免疫原性较强的抗原可不用佐剂，但一般可溶性蛋白）免疫原性较强的抗原可不用佐剂，但一般可溶性蛋白 抗原免疫时需要佐剂，并且乳化要充分。一般多采用抗原免疫时需要佐剂，并且乳化要充分。一般多采用 背部多点注射法免疫小鼠背部多点注射法免疫小鼠35只。只。3）选用高质量血清，细胞融合时可不用饲养细胞，但亚）选用高质量血清，细胞融合时可不用饲养细胞，但亚 克隆时应加入饲养细胞。克隆时应加入饲养细胞。现在学习的是第29页，共30页感谢大家观看现在学习的是第30页，共30页