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1、LOGO荧光偏振免疫分析荧光偏振免疫分析-by沈未沈未n荧光偏振荧光偏振(fluorescence polarization,FP)通常通常定义为定义为:用垂直方向用垂直方向(丄丄)的偏振光激发荧光分子的偏振光激发荧光分子,然后测然后测量发射偏振光在垂直方向量发射偏振光在垂直方向(丄丄)和水平方向和水平方向(丨丨)的荧光的荧光光强度光强度(丨丨)n早期的荧光偏振研究均以早期的荧光偏振研究均以P表示表示,目前其仍常用于临床目前其仍常用于临床化学和药物筛选化学和药物筛选;而而A多生物学检测多生物学检测,是因其便于进行数是因其便于进行数据分析和解释某些相关的物理学参数。据分析和解释某些相关的物理学参
2、数。uFP值是一个比值值是一个比值,一般一般以以mP表示表示(1P=1000mP)。u分子固定不动分子固定不动,即完全即完全偏振时偏振时,FP值是值是P0=1000 mP,是理是理论上的最大值论上的最大值;u在一个分子可以自由在一个分子可以自由运动的系统中运动的系统中,根据分根据分子运动速度的快慢子运动速度的快慢,荧荧光偏振值大约在光偏振值大约在0 500 mP之间之间.论文的结构和主要内容论文的结构和主要内容u如果待测样本中竞争抗原含如果待测样本中竞争抗原含量很少量很少(低于检测限低于检测限),荧光荧光标记抗原与抗体结合标记抗原与抗体结合,FP值值较高较高(一般在一般在150-300 mP)
3、。u而待测样本中竞争抗原的浓而待测样本中竞争抗原的浓度增加时度增加时,荧光标记抗原以荧光标记抗原以游离的形式存在于样本中游离的形式存在于样本中,FP值便会下降值便会下降,一般在一般在30-60 mP即为完全抑制即为完全抑制uFPIA是均相的竞争免疫是均相的竞争免疫分析方法分析方法,反应完全在溶反应完全在溶液系统中液系统中,不需要分离结不需要分离结合的和未结合的抗体。合的和未结合的抗体。u实验操作过程非常简单实验操作过程非常简单,仅仅是将抗体仅仅是将抗体,荧光标记荧光标记的抗原和抗原加入到反应的抗原和抗原加入到反应杯中杯中,经过几分钟甚至是经过几分钟甚至是几秒钟的温育便可直接测几秒钟的温育便可直
4、接测量量,很快得到被测抗原的很快得到被测抗原的浓度。浓度。组蛋白对组蛋白对DNA荧光偏振度影响荧光偏振度影响u1.制备制备DNA-组蛋白复合体组蛋白复合体:-DNA(48kbp)用荧光染料用荧光染料YOYO-1标记标记,碱基对与染料分子之碱基对与染料分子之比为比为10:1;用用 Bis-Tris缓冲液缓冲液(50mmol/L,pH6.6)稀释组蛋白溶液稀释组蛋白溶液;组蛋白浓度是组蛋白浓度是DNA的的10500倍倍;DNA/YOYO-1溶液溶液(6.5 pmol/L)和稀释后的组蛋白溶液共同和稀释后的组蛋白溶液共同保温保温(37)培育培育3h,反应液体积为反应液体积为2mL;组蛋白对组蛋白对D
5、NA荧光偏振度影响荧光偏振度影响u2.荧光偏振度测量荧光偏振度测量:用用MOS-450/CD测量测量,其是一个标准的荧光偏振度测量模式其是一个标准的荧光偏振度测量模式;在测量荧光偏振度时在测量荧光偏振度时,偏振光弹性调制器自动设置在半波长模偏振光弹性调制器自动设置在半波长模式式,这样激发光在水平分量和垂直分量之间以这样激发光在水平分量和垂直分量之间以100 kHz 的的频率转换频率转换;应用应用Bio-Kine 软件软件(Bio-Logic)通过两个散射信号实时计通过两个散射信号实时计算荧光强度和荧光偏振度算荧光强度和荧光偏振度;组蛋白对组蛋白对DNA荧光偏振度影响荧光偏振度影响u3.DNA-
6、组蛋白复合体荧光偏振度随组蛋白与组蛋白复合体荧光偏振度随组蛋白与DNA 浓度比变化关系曲线浓度比变化关系曲线组蛋白对组蛋白对DNA荧光偏振度影响荧光偏振度影响u4.对图表的解释对图表的解释:在溶液中单独存在时在溶液中单独存在时,DNA分子随机卷曲且有弹性此构型对应着分子随机卷曲且有弹性此构型对应着一定的偏振度值一定的偏振度值.在我们的实验条件下在我们的实验条件下,DNA 分子的荧光偏振分子的荧光偏振度在度在0.11左右左右;在组蛋白的作用下，在组蛋白的作用下，DNA分子发生了凝聚分子发生了凝聚;DNA-组蛋白分子可能呈现更紧密、更小的构型组蛋白分子可能呈现更紧密、更小的构型,导致复合体分子导致
7、复合体分子比比 DNA 分子旋转更快分子旋转更快,对应较小的荧光偏振度值对应较小的荧光偏振度值;荧光偏振研究的一般步骤荧光偏振研究的一般步骤u1.确定最佳的荧光标记物确定最佳的荧光标记物;u2.确定公式中的各种参数确定公式中的各种参数;u3.倍比稀释结合物，根据不同的倍比稀释结合物，根据不同的FP值确定最优稀释比，使值确定最优稀释比，使其结合能力与其结合能力与FP值成线性关系值成线性关系;u4.建立标准曲线建立标准曲线;u5.分析结果分析结果,验证实验猜想。验证实验猜想。荧光偏振免疫分析的优点荧光偏振免疫分析的优点u1.均相系统均相系统,不需要洗涤操作不需要洗涤操作,可大大减少试剂的用量。可大
8、大减少试剂的用量。u2.检测速度很快检测速度很快,且易于自动化且易于自动化,适于快速的筛选检测。适于快速的筛选检测。u3.荧光标记抗原的均一性好荧光标记抗原的均一性好,性质稳定性质稳定,可长期保存可长期保存,方法的重现性好。方法的重现性好。u4.FP值是一个比值值是一个比值,与其他荧光检测技术相比与其他荧光检测技术相比,不易受溶液颜色和仪器灵不易受溶液颜色和仪器灵敏度变化的影响，实验结果稳定敏度变化的影响，实验结果稳定,可靠性高。可靠性高。u5.选用不同发射波长的荧光素来进行多标记检测选用不同发射波长的荧光素来进行多标记检测,可实现多目标物的同时可实现多目标物的同时定性及定量分析。如四甲基罗丹
9、明定性及定量分析。如四甲基罗丹明,其激发和发射光谱与荧光素的重叠很其激发和发射光谱与荧光素的重叠很少少,因此相互之间基本不会干扰因此相互之间基本不会干扰,现已在多标记检测中得到应用。现已在多标记检测中得到应用。荧光偏振免疫分析的缺点荧光偏振免疫分析的缺点u1.FPIA比比ELISA方法的灵敏度低。一般来说方法的灵敏度低。一般来说FPIA的检测限为的检测限为0.1-10ng/mL-1左右。左右。u2.FPIA易受样本基质易受样本基质(如与基质蛋白的非特异性结合如与基质蛋白的非特异性结合),背景荧光背景荧光和光散射的影响。和光散射的影响。u3.FPIA的检测信号的背景较高的检测信号的背景较高,检测
10、范围检测范围(窗口窗口)较窄较窄,信噪比信噪比(S/N)较低。较低。u4.FPIA对荧光标记物的纯度要求较高对荧光标记物的纯度要求较高,需耍较复杂的纯化步骤。需耍较复杂的纯化步骤。u5.FPIA检测需要特定的分析仪器检测需要特定的分析仪器,或对普通的荧光分光光度计增或对普通的荧光分光光度计增加测量偏振附件。因此价格较普通酶标仪昂贵。加测量偏振附件。因此价格较普通酶标仪昂贵。对本实验室研究的思考对本实验室研究的思考u当研究对象为与核酸当研究对象为与核酸(DNA/RNA)互作的蛋白时，可以在互作的蛋白时，可以在核酸的末端加上一个荧光标签核酸的末端加上一个荧光标签,研究二者之间的结合关系研究二者之间的结合关系,包包括结合常数括结合常数,动力学参数等等。动力学参数等等。u推而广之，还通过核推而广之，还通过核酸等小分子研究蛋白酸等小分子研究蛋白-蛋白复合物之间的蛋白复合物之间的结合。结合。