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1、第6章 荧光偏振分析方法,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,光的偏振性,非偏振光原理图,偏振光原理图,自然光在各个方向振动是均匀分布的,一束光线都在同一方向上振动,荧光偏振 （Fluorescence Polarization，FP）,Polarized excitation,1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。 如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性； 如果被激发的荧光物质处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性，也就是所谓的荧光去偏振现象。,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,如何衡量：偏振值的定义,
2、偏振值一般以mP（毫偏）来表示,对于完全偏振发射，P = r = 1；对于自然光，P = r = 0,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,偏振值的影响参数,偏振值衡量荧光分子的运动性,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,分子的偏振性与分子旋转弛豫时间成比例，分子旋转弛豫时间是分子转过68.5度角时所用的时间； 分子旋转弛豫时间与介质黏度、绝对温度、分子体积和分子重量和气体常数有关。,20世纪50年代Weber进一步拓展了荧光偏振理论并首次将荧光偏振用于生化分析领域。 20世纪80年代，随着荧光探针和荧光偏振分析仪器商业化，荧光偏振技术在生命科学等各个领域扮演越来越重要的角色。,6.1
3、传统荧光偏振技术及发展情况概述,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,荧光偏振分析的一般步骤,利用荧光偏振的原理，通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析。 如果被检测分子大，激发时运动慢，测得的荧光偏振光值高。如果分子小，分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振光值低，从而计算出样品的偏振值（偏振值单位 mP）。 通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。,荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 (特别是不生成有害的放射性废物) 并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光偏
4、振是真正均相的，允许实时检测 (动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均相检测形式 (中间不含洗涤步骤 ) 的最佳解决方案。,荧光偏振技术的优势:,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,常用的测试仪器及配件,国内外研究现状及发展动态分析,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,1. 荧光偏振免疫分析,荧光偏振免疫分析法 (fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 是一种定量免疫分析技术。,荧光偏振免疫分析原理,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,1. 荧光偏振免疫分析,近年来，FPIA备受生物、化学、医学专家们的亲睐，有关FPIA在临床化学、农
5、药残留分析、食品安全、环境监测中应用的报道逐年增加，成为生化分析和环境监测中强有力的工具。,优点：均相分析无需分离、迅速、灵敏、无放射性污染、重现性高；,缺点：FPIA不如酶联免疫吸附测定(ELISA)灵敏，且荧光标记物可能会与样本中的基质特异性结合，使荧光偏振值增加，产生一定干扰。,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,蛋白质与核酸的相互作用是许多生命活动的重要部分，因此成为分子生物学研究的一个热点,荧光偏振技术为研究蛋白质-核酸相互作用提供了一个免分离、免放射性的途径,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,2. 蛋白质-核酸相互作用,2. 蛋白质-核酸相互作用,核酸适配体 (aptam
6、er) 是通过SELEX技术筛选得到的能与蛋白质、小分子、金属离子等靶标结合的寡核苷酸序列，由于其易合成和修饰、稳定性好、成本低，已广泛应用于分析应用领域,传统分子量依赖性FA用于研究蛋白质-核酸相互作用的原理,Biosens. Bioelectron. 2012, 32, 148-154.,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,3. 核酸分析,Chem. Commun. 2011, 47, 3478-3480.,改进传统的荧光偏振检测方法，通过引入酶促反应扩增检测信号应用于超灵敏检测特异性DNA的检测。,超灵敏检测DNA,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,3. 核酸分析,Nuclei
7、c Acids Res. 2003, 31: e70.,实时监测DNA双链的形成和解链过程,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,4. 水解酶催化反应,Chem. Rev. 2010, 110, 2685-2708.,实时监测蛋白酶催化过程,蛋白酶对机体的新陈代谢和生物调控起到非常重要的作用；,蛋白酶酶活的评估有助于理解特定的生化途径、开发治疗药物。,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,Anal. Chem. 2009, 81, 7468-7473.,非竞争法检测小分子化合物,5. 小分子分析,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,空间构象变化,Anal. Bioanal. Chem.
8、 2011, 401, 3229-3234.,磷酸二酯酶I介导的荧光偏振传感平台,5. 小分子分析,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,Chem. Commun. 2012, 48, 1000410006.,多元检测方法,5. 小分子分析,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,传统荧光偏振分析技术面临的挑战：,荧光偏振变化量较小，灵敏度较低,解决的方案,?,MAP探针 (Mass Amplifying Probe),6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,Anal. Chem. 1995, 67, 3945-3951.,核酸检测,蛋白质增强荧光偏振,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
9、,Anal. Chem. 2012, 84, 5535-5541.,小分子检测,蛋白质增强荧光偏振,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,凝血酶 (thrombin),小分子检测,Anal. Chem. 2012, 84, 7203-7211.,蛋白质增强荧光偏振,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,单链结合蛋白SSBP (Single-strand binding proteins）,离子检测,Analyst, 2012, 137, 2770-2773.,特殊结构核酸增强荧光偏振,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,一. 调节机体和细胞的渗透压 二. 调节体液的酸碱平衡 三. 参与
10、体内蛋白质和糖类的代谢 四. 维持正常的神经兴奋性和心肌运动,K+的作用,离子和小分子检测,Chem. Commun. 2014,50, 2049-2051.,特殊结构核酸增强荧光偏振,6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述,与蛋白质和核酸相比，纳米材料具有良好的热稳定性、更大的质量和体积且易于合成和进行表面修饰，因此用纳米材料增强荧光偏振具有潜在的应用价值。,纳米材料,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,纳米粒子显著增大了分子相互作用的荧光偏振值变化,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8386-8389.,汞离子检测荧
11、光偏振探针检测限达到0.2 ppb，比传统荧光偏振方法提高3个数量级，检测时间只需20分钟，具有良好的特异性,MAP探针,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,AuNP-DNA System,DNA-DNA System,AuNP Enhancement,0.2 ppb,Quantitative Analysis,Anal. Biochem. 2010, 401, 47-52.,DNAzyme自组装荧光偏振探针,MAP探针,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,Chem. Commun. 2012, 48, 7480-7482.,纳米二氧化硅颗粒增强
12、荧光偏振探针,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,Chem. Commun. 2011, 47, 4763-4765.,核酸酶检测及药物筛选,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,Biosensors and Bioelectronics, 2013, 41, 569-575.,基于链置换反应开发的纳米金颗粒增强荧光偏振探针,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,J. Mater. Chem. B, 2013, 1, 2018-2021.,T4 polynucleotide kinase activity and inhibition,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,6.2 纳
13、米增强荧光偏振一般策略及应用,Chem. Asian J. 2014, 9, 2755-2760.,聚乙烯纳米颗粒增强荧光偏振信号放大分析方法,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,金纳米颗粒、硅纳米颗粒等虽然能有效增强荧光偏振值，但是探针与纳米颗粒需要复杂的共价连接；,开发一种普适、简单的荧光偏振增强剂仍然是一个重要的任务。,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,纳米材料的生物功能化方法,非共价功能化途径,静电相互作用,-堆积作用,范德华力,碳基纳米材料：石墨烯，碳纳米管，碳纳米颗粒等,ssDNA/dsDNA与碳基纳米材料之间的相互作用差别悬殊,与DNA发生-堆积作用,与多肽发生-静电作
14、用等,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,Chem. Commun. 2013, 49, 1942-1944.,氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,“signal-off”,“signal-on”,Anal. Chem. 2013, 85, 1424-1430.,氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,Materials Science and Engineering C 2014, 38, 206-211.,碳纳米颗粒增强荧光偏振信号分析方法,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,Biosensors and Bioelectronics, 2014, 54, 285-291.,碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,Chem. Asian J. 2014, 9, 87-92.,碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,纳米球形聚电解质刷增强荧光偏振信号分析方法,ChemBioChem 2010, 11, 494-497.,6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用,Acta Chim. Sinica 2013, 71, 1620-1624.,二氧化钛纳米棒增强荧光偏振信号分析方法,