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1、时间分辨荧光免疫分析技术现在学习的是第1页，共23页标记免疫学分析技术发展历程标记免疫学分析技术发展历程n n免疫荧光分析免疫荧光分析(Coons,1941Coons,1941)n n放射免疫分析放射免疫分析(Berson(Berson和和Yalow,1960)Yalow,1960)n n酶免酶免ELISA(Engvall,1971)ELISA(Engvall,1971)n n金标免疫分析金标免疫分析(Faulk(Faulk和和Taylor,1971)Taylor,1971)n n化学发光免疫分析化学发光免疫分析(Arakawa(Arakawa，1977)1977)n n时间分辨荧光免疫分析时
2、间分辨荧光免疫分析(Soini(Soini和和HemmilaHemmila，1979)1979)n n电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(Leland,1990)(Leland,1990)n n液相芯片液相芯片(美国美国LuminexLuminex公司公司,1997),1997)现在学习的是第2页，共23页免疫荧光免疫荧光放射免放射免疫疫化化 学学 发发光光电化学发光电化学发光 时间分辨荧光时间分辨荧光酶联免酶联免疫疫现在学习的是第3页，共23页标记免疫技术的理论检测灵敏度标记免疫技术的理论检测灵敏度n n放射免疫放射免疫 1010-10-10-10-10-12-12 molmoln n酶联
3、免疫酶联免疫 1010-9-9-10-10-10-10 mol moln n化学发光化学发光 1010-15-15 molmoln n时间分辨荧光时间分辨荧光 1010-18-18 molmoln n电化学发光电化学发光 1010-18-18 molmol现在学习的是第4页，共23页一、时间分辨荧光免疫分析（一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIATRFIA）（Time-resolved fluorescence immunoassayTime-resolved fluorescence immunoassay）n n背景介绍背景介绍n n基本原理基本原理n n技术特点技术特点n n反应模式反应模
4、式现在学习的是第5页，共23页背景介绍背景介绍l l1979197919791979年，芬兰年，芬兰年，芬兰年，芬兰WallacWallacWallacWallac公司研发部的公司研发部的公司研发部的公司研发部的SoiniSoiniSoiniSoini 和和和和 Hemmila Hemmila Hemmila Hemmila首次首次首次首次提出了建立提出了建立提出了建立提出了建立 稀土离子标记物的稀土离子标记物的稀土离子标记物的稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析”理论理论理论理论l l1983198319831983年，年，年，年
5、，Soini Soini Soini Soini 和和和和 KojolaKojolaKojolaKojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨 荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年，荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年，荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年，荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年，Pettersson Pettersson Pettersson Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促
6、性腺激素等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素 (hCG)(hCG)(hCG)(hCG)进行了时间进行了时间进行了时间进行了时间 分辨荧光免疫分析分辨荧光免疫分析分辨荧光免疫分析分辨荧光免疫分析l l1984198419841984年，年，年，年，HemmilaHemmilaHemmilaHemmila确定了确定了确定了确定了DELFIA(Dissociation Enhanced LanthanideDELFIA(Dissociation Enhanced LanthanideDELFIA(Dissociation Enh
7、anced LanthanideDELFIA(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay)Fluoroimmunoassay)Fluoroimmunoassay)Fluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案这种时间分辨免疫分析技术方案这种时间分辨免疫分析技术方案这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使从而使从而使从而使DELFIADELFIADELFIADELFIA成成成成 为为为为WallacWallacWallacWallac的专利技术的专利技术的专利技术的专利技术l l1988198819881988年，加拿大年，
8、加拿大年，加拿大年，加拿大CyberFluorCyberFluorCyberFluorCyberFluor公司的公司的公司的公司的DiamandisDiamandisDiamandisDiamandis创立了一种不同于创立了一种不同于创立了一种不同于创立了一种不同于DELFIADELFIADELFIADELFIA 的时间分辨荧光免疫分析，即的时间分辨荧光免疫分析，即的时间分辨荧光免疫分析，即的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgenFIAgenFIAgenFIAgenl l2003200320032003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖年，时
9、间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖现在学习的是第6页，共23页基本原理基本原理l l三价稀土离子包括有铕三价稀土离子包括有铕三价稀土离子包括有铕三价稀土离子包括有铕(Eu)(Eu)，钐（，钐（，钐（，钐（Sm)Sm)，铽，铽，铽，铽 (Tb)(Tb)，镝，镝，镝，镝 (Dy)(Dy)等，它们的荧光光谱具有特异性强等，它们的荧光光谱具有特异性强等，它们的荧光光谱具有特异性强等，它们的荧光光谱具有特异性强 Stokes Stokes位移大位移大位移大位移大寿命长寿命长寿命长寿命长 的特点的特点的特点的特点l lDELFIADELFIA采用异硫氰酸苄基
10、二亚乙基三胺四乙酸铕采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合为双功能螯合试剂，其一端螯合为双功能螯合试剂，其一端螯合为双功能螯合试剂，其一端螯合EuEu3+3+，另一端可与蛋白质的，另一端可与蛋白质的，另一端可与蛋白质的，另一端可与蛋白质的-NH NH2 2 连接。在中性或接近中性连接。在中性或接近中性连接。在中性或接近中性连接。在中性或接近中性pH pH 条件下，条件下，条件下，条件下，DTTA DTTA 与与与与EuEu3+3+具具具具 有足够的螯合稳定性，而
11、在增强液（呈酸性）作用下，有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA-DTTA-Eu Eu 又能将螯合的又能将螯合的又能将螯合的又能将螯合的EuEu3+3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的迅速、彻底地释放出来并与增强液中的迅速、彻底地释放出来并与增强液中的迅速、彻底地释放出来并与增强液中的 配体螯合配体螯合配体螯合配体螯合进入胶束的疏水内核，使进入胶束的疏水内核，使进入胶束的疏水内核，使进入胶束的疏水内核，使EuEu3+3+荧光得以成千万倍地荧光得以成千万倍地荧光得以成千万倍地荧光得
12、以成千万倍地 放大放大放大放大l lFIAgenFIAgen采用的是以采用的是以采用的是以采用的是以EuEu3+3+螯合物配基螯合物配基螯合物配基螯合物配基BCPDABCPDA为标记物，为标记物，为标记物，为标记物，通过检测其与过量通过检测其与过量通过检测其与过量通过检测其与过量EuEu3+3+形成的螯合物荧光进行定量。由于形成的螯合物荧光进行定量。由于形成的螯合物荧光进行定量。由于形成的螯合物荧光进行定量。由于 BCPDA BCPDA 的可检测性不够理想，的可检测性不够理想，的可检测性不够理想，的可检测性不够理想，FIAgen FIAgen 需要利用生物素需要利用生物素需要利用生物素需要利用
13、生物素-亲合素信号放大来弥补亲合素信号放大来弥补亲合素信号放大来弥补亲合素信号放大来弥补BCPDA BCPDA 检测灵敏度的不足检测灵敏度的不足检测灵敏度的不足检测灵敏度的不足现在学习的是第7页，共23页DELFIADELFIA标记技术标记技术标记技术标记技术碱性碱性碱性碱性现在学习的是第8页，共23页时间时间:(s:(s）04008001000340nm340nm激发光激发光第二个循环第二个循环荧荧光光短短短短寿寿寿寿命命命命荧荧荧荧光光光光613nm613nm613nm613nm长寿命荧光长寿命荧光长寿命荧光长寿命荧光延迟时间延迟时间延迟时间延迟时间测值时间测值时间测值时间测值时间通过时间
14、延迟，将特异性荧光与非特异性荧光通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使理论本底达到分辨开来，使理论本底达到分辨开来，使理论本底达到分辨开来，使理论本底达到0 0现在学习的是第9页，共23页300300300300400400400400500500500500600600600600荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度激发光激发光激发光激发光发射光发射光发射光发射光波长波长波长波长(nm)(nm)(nm)(nm)现在学习的是第10页，共23页TbTbDyDyEuEuSmSm500500发发射射光光强强度度2002004004000 0延迟时间延迟时间(s)600600发射光波长发射光
15、波长(nm)(nm)500500发发射射光光强强度度0 0延迟时间延迟时间(s)现在学习的是第11页，共23页TRFIA技术特点技术特点l l极长的荧光衰退时间极长的荧光衰退时间 铕：铕：铕：铕：730000ns730000ns730000ns730000ns l lStokesStokes位移大位移大 铕：激发光铕：激发光铕：激发光铕：激发光340340340340nmnmnmnm，发射光，发射光，发射光，发射光613nm613nm613nm613nml l狭窄的发射峰狭窄的发射峰l l解离解离-增强技术可使其荧光性提高增强技术可使其荧光性提高100100万倍万倍现在学习的是第12页，共23
16、页固相包被抗体固相包被抗体铕标记抗体铕标记抗体孵育孵育Eu待测抗原待测抗原+EuEu+增强液增强液+Eu双抗体夹心法示意图双抗体夹心法示意图现在学习的是第13页，共23页双抗原夹心法示意图双抗原夹心法示意图Eu+孵育孵育+Eu孵育孵育增强液增强液+Eu固相包被抗原固相包被抗原待测抗体待测抗体铕标记抗原铕标记抗原现在学习的是第14页，共23页中和法示意图中和法示意图(回滴定法回滴定法)+孵育孵育+Eu孵育孵育EuEu增强液增强液+Eu待测抗体待测抗体铕标记抗体铕标记抗体中和抗原中和抗原现在学习的是第15页，共23页小分子抗原竞争抑制示意图小分子抗原竞争抑制示意图固相包被二抗固相包被二抗+孵育孵育
17、+Eu孵育孵育Eu待测抗原待测抗原铕标抗原铕标抗原Eu增强液增强液+Eu一抗一抗现在学习的是第16页，共23页时间分辨技术重点和难点时间分辨技术重点和难点n n固定相（固定相（9696孔板）孔板）n n标准品标准品n n铕标记物铕标记物现在学习的是第17页，共23页二、时间分辨荧光免疫分析（二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）测试仪测试仪现在学习的是第18页，共23页目前的目前的TRFIA测试仪：测试仪：n n国外仪器（国外仪器（国外仪器（国外仪器（WallacWallac公司公司）n n国内其他公司生产的仪器国内其他公司生产的仪器(上海新波、广州丰华等上海新波、广州丰华等)n n达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（DR-M6601）现在学习的是第19页，共23页Wallac AutoDELFIA 1235现在学习的是第20页，共23页半自动 VICTOR2 1420现在学习的是第21页，共23页半自动 ANYTEST2000现在学习的是第22页，共23页DR-M6601DR-M6601时间分辨荧光免疫分析仪时间分辨荧光免疫分析仪【粤食药管械（准）字粤食药管械（准）字20052005第第24002262400226】现在学习的是第23页，共23页