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1、实验七实验七 微生物的分离与纯化技术微生物的分离与纯化技术 n土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。有价值的菌株。n一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中。而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中。n从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一
2、株微从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的生物的过程称为微生物的分离与纯化分离与纯化。n平板分离法平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。普遍用于微生物的分离与纯化。n基本原理基本原理是选择适合于待分离微生物生长的条件，是选择适合于待分离微生物生长的条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧的要求，或加入如营养成分、酸碱度、温度和氧的要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。生物。一、实验目的和内容一、实验目的和内容目的：目的：学习从土
3、壤中分离微生物的方法，学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。学习无菌操作技术。内容：内容：1 1 培养基的配制及相关物品的灭菌；培养基的配制及相关物品的灭菌；2 2 用稀释法从土壤中分离微生物；用稀释法从土壤中分离微生物；用平板划线方法分离微生物用平板划线方法分离微生物 二、实验材料和用具二、实验材料和用具n牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏1号固体培号固体培养基，土豆蔗糖固体培养基，养基，土豆蔗糖固体培养基，99mL无菌水无菌水(带玻璃珠带玻璃珠)，9mL无菌水，无菌水，10%酚液，土酚液，土壤样品壤样品n无菌培养皿、无菌培养皿、1mL无菌移液管、天平、称无菌
4、移液管、天平、称量纸、药勺、试管架量纸、药勺、试管架n高压灭菌锅高压灭菌锅三、操作步骤三、操作步骤（一）（一）固体培养基的配制固体培养基的配制（人一组）（人一组）l 称量和溶解称量和溶解 2pH调节、分装（三角瓶）调节、分装（三角瓶）、包扎、包扎。3.灭菌灭菌(二二)土壤稀释分离土壤稀释分离（人一组）（人一组）1取土壤取土壤 取表层以下取表层以下510cm处的土样，放入无菌的袋或处的土样，放入无菌的袋或瓶中备用，或放在瓶中备用，或放在4冰箱中暂存。冰箱中暂存。2制备稀释液制备稀释液(要要无菌操作无菌操作)(1)准备准备三角瓶装三角瓶装99mL水（加玻璃珠），水（加玻璃珠），1只；只；试管装试管
5、装4.5mL无菌水，；无菌水，；包扎、灭菌包扎、灭菌 角匙一只角匙一只（2）制备土壤悬液：）制备土壤悬液：无菌角匙无菌角匙称土样称土样1g，迅速倒入带玻璃珠的，迅速倒入带玻璃珠的99mL无无菌水瓶中菌水瓶中(玻璃珠用量玻璃珠用量10粒左右粒左右)，振荡，振荡510min，使土样充分打散，即成为，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。的土壤悬液。u在每根无菌移液管的报纸套上做好标记，如在每根无菌移液管的报纸套上做好标记，如10-3、10-4、10-5。u无菌移液管用前从中间拆开报纸套，取出移液管，无菌移液管用前从中间拆开报纸套，取出移液管，用后再插回报纸套，用后再插回报纸套，保护移液管尖端保
6、护移液管尖端。u每次每次吸取土液吸取土液，要将移液管插入液面，以口吹吸，要将移液管插入液面，以口吹吸3次，每次吸上的液次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。面要高于前一次，以减少稀释中的误差。u放土液放土液操作时移液管尖不能接触下一稀释度液体的液面，每一个稀释操作时移液管尖不能接触下一稀释度液体的液面，每一个稀释度换用一支移液管。度换用一支移液管。(3)稀释：稀释：用无菌移液管吸用无菌移液管吸10-2的土壤悬液的土壤悬液1mL，放入，放入9mL无菌水中即为无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成稀释液，如此重复，可依次制成10-310-的稀释液。的稀释液。3.平板接种培养
7、平板接种培养 3.1稀释倾注平板法稀释倾注平板法(混菌混菌)u细菌细菌:取取10-6、10-7两管稀释液各两管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿，每个稀，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿。释度接两个平皿。取冷却至取冷却至50（以不烫手为宜）（以不烫手为宜）的的牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基，分别倒入以上，分别倒入以上培养皿中培养皿中(装量以铺满皿底为宜，约装量以铺满皿底为宜，约10-15ml)，迅速摇动平皿，使菌液，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意倒平
8、板时要注意无菌操作。无菌操作。u放线菌放线菌 取取10-4、10-5两管稀释液各两管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿。两个平皿。取冷却至取冷却至50（以不烫手为宜）（以不烫手为宜）的的高氏高氏1号培养基号培养基（添加（添加10%酚数滴）酚数滴），分别倒入以上培养皿中分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底为宜，约装量以铺满皿底为宜，约10-15mL)，迅速摇动，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成放线菌平板。放线菌平板。u 霉菌霉菌取取1
9、0-4、10-5两管稀释液各两管稀释液各1ML，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿两个平皿 取冷却至取冷却至50（以不烫手为宜）（以不烫手为宜）的的土豆蔗糖培养基土豆蔗糖培养基，分别倒入以上培养，分别倒入以上培养皿中皿中(装量以铺满皿底为宜，约装量以铺满皿底为宜，约10-15mL)，迅速摇动平皿，使菌液与培，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成霉菌平板。养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成霉菌平板。n倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用
10、右手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口旁边，用右手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约打开一缝，迅速倒入培养基约10mL，加盖后轻轻摇动，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于平置于桌面上，待凝后即为平板。桌面上，待凝后即为平板。3.2 平板划线分离法。平板划线分离法。u倒平板倒平板 按无菌操作要求，在火焰旁操作，倒固体培养基平板。按无菌操作要求，在火焰旁操作，倒固体培养基平板。u划线分离划线分离 使用接种
11、环，使用接种环，挑取挑取-土壤悬液，在平板中划线分离。土壤悬液，在平板中划线分离。划线的方法多样，目的是划线的方法多样，目的是获得单个菌落获得单个菌落。n用接种环以无菌操作挑取用接种环以无菌操作挑取-土壤悬土壤悬液，先在平板培养基的一边作第一次平液，先在平板培养基的一边作第一次平行划线行划线34条，再转动培养皿约条，再转动培养皿约70度角，度角，并将并将接种环上剩余物烧掉接种环上剩余物烧掉，待冷却后通待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线。第三次划线。掌握好力度，不要划破培养基
12、。掌握好力度，不要划破培养基。4培养培养 将接种好的平板将接种好的平板倒置倒置，即皿盖朝下放置，即皿盖朝下放置，(可减少可减少培养基水分蒸发、可减少污染培养基水分蒸发、可减少污染)，培养细菌：培养细菌：37，恒温培养箱中培养，恒温培养箱中培养12d。培养放线菌：培养放线菌：28，恒温培养箱中培养，恒温培养箱中培养35d。培养霉菌：培养霉菌：28，恒温培养箱中培养，恒温培养箱中培养35d。四、结果四、结果观察从土壤稀释分离的微生物观察从土壤稀释分离的微生物菌落菌落F 菌落特征描述菌落特征描述菌落特征包括菌落特征包括大小，形状，隆起形状，边缘情况，表面状态，表大小，形状，隆起形状，边缘情况，表面状
13、态，表面光泽，质地，颜色，透明度等面光泽，质地，颜色，透明度等。菌落特征菌落特征细菌细菌菌落一般呈现湿润较光滑，较粘稠，易挑起，质地菌落一般呈现湿润较光滑，较粘稠，易挑起，质地均匀，菌落正反面及边缘中心部位颜色一致均匀，菌落正反面及边缘中心部位颜色一致放线菌放线菌干燥、不透明、表面呈致密的丝绒状，上有一层彩干燥、不透明、表面呈致密的丝绒状，上有一层彩色色“干粉干粉”难挑起，菌落正反面颜色不一致难挑起，菌落正反面颜色不一致霉菌霉菌菌落的形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，菌落的形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的蛛网状、绒毛状、棉絮状，与培养呈现或松或紧的蛛网状、绒毛状、棉絮状，与培养基结合紧密，不易挑起基结合紧密，不易挑起酵母菌酵母菌较湿润，较透明，表面较光滑，容易挑起，菌落质较湿润，较透明，表面较光滑，容易挑起，菌落质地均匀，正反面以及边缘与中央部位的颜色一致。地均匀，正反面以及边缘与中央部位的颜色一致。颜色多为白色，少数为红色。颜色多为白色，少数为红色。粘质沙雷氏菌细菌菌落青霉的菌落 n观察结束，清洗培养皿。观察结束，清洗培养皿。