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1、HPLC-ESI-MS法分析山茱萸炮制前后的化学成分 山茱萸炮制 摘 要：目的：建立高效液相色谱-电喷雾-质谱（HPLC-ESI-MS）方法，分析比较山茱萸炮制前后化学成分的改变。方法：采纳Agilent Extend-C18色谱柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱；Agilent1200高效液相色谱仪6410 三重四级杆质谱仪联用；正、负离子检测模式。结果：通过质谱中的主要碎片，在正离子检测模式下，山茱萸生品中检测出了莫诺苷、马钱苷、山茱萸裂苷，制品中检测出了5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷和山茱萸裂苷；在负离子检测模式下，山茱萸生、制品中均检测出了没食子酸、7-O-没食子酰基景天庚酮糖、莫诺
2、苷、山茱萸裂苷。结论：在质谱正、负离子检出模式下，主要化学成分响应均较好，这为分析山茱萸炮制前后化学成分改变，以及限制饮片质量供应了一种新的方法。 关键词：HPLC-ESI-MS；山茱萸；炮制；化学成分 中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0062-04 Analysis on Active Components in Crude And Processed Cornus Officinals by HPLC-ESI-MS DU Weifeng1, ZHANG Yun1,CONG Xiaodong1, CAI Baochang1,2 (1.R
3、esearch Center of TCM Processing Technology,Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311401,Zhejiang,China; 2.Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029,Jiangsu,China) Abstract:Objective：To establish an analytical method for com
4、paring the components in crude and processed Cornus officinalis by HPLC-ESI-MS. Methods: These components were analyzed with a Agilent Extend-C18 by gradient elution using 0.1% (V/V) methanoic acid water-solution-acetonitrile as the mobile phase,using Agilent 1200 HPLC-6410 QQQ MS, and detected in p
5、ositive and negative ion mode. Results: Through fragments mass information in positive ion mode, three compounds(morroniside, lognain and cornuside)were detected in crude drug and four ones(5-HMF, morroniside, lognain and cornuside) in processed product; in negative ion mode, four compounds(gallic a
6、cid, 7-O-galloyl-D-sedohep-tulose, morroniside and cornuside) were detected in all crude drug and processed product. Conclusion: In positive and negative ion mode, the main active components all could be detected well. The analytical method could be applied to the intrinsic quality control of crude
7、and processed Cornus officinalis. Key words:HPLC-ESI-MS; Cornus officinalis; processed; active components 山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉。临床上多用山萸肉、酒山萸肉。山萸肉长于敛汗固脱，用于自汗或大汗不止，阴虚盗汗；经酒蒸制后，补益肝肾作用增加，多入滋补方剂，常用于眩晕耳鸣，阳痿遗精，遗尿，尿频，月经过多或崩漏，腰部酸痛等1。山茱萸中主要含有多糖类、环烯醚萜苷类、鞣质类、有机酸类等。本课题组前期探讨，主要采纳紫外光
8、谱法或高效液相色谱法分析比较了山茱萸炮制前后主要有效成分的含量改变，如：多糖、黄酮、没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷和山茱萸裂苷2-9，液质联用分析方法鲜有报道10-11。本试验利用HPLC-ESI-MS方法对山茱萸炮制前后几种化学成分进行了质谱解析。分别在质谱正负离子检出模式下，检测出多个化学成分，与传统的仅检测某一化学成分相比，更能比较炮制前后的差别，为山茱萸饮片质量限制供应了一种新的方法。 1仪器与试药 液质联用采纳Agilent 1200高效液相色谱-6410三重四极杆质谱联用仪（美国Agilent仪器公司）；AG285电子天平（0.01 mg，METTLER，Swi
9、tzerland）；KQ-500E型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。 山茱萸（批号：Y080507，产地：河南），酒萸肉（批号：080625，为山茱萸经酒蒸而得的炮制品），两者均由浙江中医药高校中药饮片厂供应，为中国药典2010版中药饮片标准探讨起草用样品，并经浙江中医药高校中药饮片厂主管中药师郑建宝老师鉴定。 甲醇、甲酸为分析纯；乙腈为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。 2试验方法 2.1液相色谱条件 Agilent 1200型高效液相色谱仪，色谱柱：Agilent Extend-C18 (2.1mm100 mm，3.5m )；流淌相：溶剂A (0.1%的甲酸水溶液)，溶剂B (乙腈)，梯度洗
10、脱：05 min，2% B；510 min，2%15% B；1020 min，15% B；2025 min，15%45% B；2535 min，45%90% B；3540 min，90% B。柱温：25；流速：0.2 mL/min；检测波长：240nm；进样量为10L。 2.2质谱条件 Agilent 6410三重四极杆质谱仪，离子源：电喷雾源( ESI)；扫描范围：1001000 (m/z)；干燥气为N2，体积流量：10 L/min；雾化气压力：45psi;干燥气温度：350 ；毛细管电压: 4000 V；Fragmentor：135V；CE：40V。 2.3 样品处理 精密称取过40目的山
11、茱萸生、制品粉末1.00g，置25mL锥形瓶中，加80%甲醇溶液定容至刻度， 称重，超声提取45 min，取出，再称重，用80%甲醇溶液补足减失的重量，取上清液过0.45m微孔滤膜作滤液作为LC-MS分析样品。 3结果和分析 3.1山茱萸提取物的总离子流色谱图 在高效液相色谱与电喷雾质谱(HPLC-ESI-MS)联用试验中，首先通过在正离子模式（Positive）和负离子（Negative）模式下的全扫描（Scan），检测到各峰在不同模式下的分子离子峰，确定可能分子量。为进一步验证这些色谱峰对应化合物的结构，在相同的条件下做了质谱的子离子扫描（Product ion），以获得峰对应化合物的结构
12、信息。 山茱萸提取物的总离子流色谱图中，正、负离子模式下的质谱响应均较好。在正离子检测模式下，山茱萸生品中检测出了莫诺苷、马钱苷、山茱萸裂苷，制品中检测出了 5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷和山茱萸裂苷；在负离子检测模式下，山茱萸生、制品中均检测出了没食子酸、7-O-没食子酰基景天庚酮糖、莫诺苷和山茱萸裂苷。 总离子色谱图见图14。 3.2 山茱萸化学成分的分析 样品同时采纳紫外检测，得到液相色谱图。色谱峰通过与标准品的保留时间和紫外光谱比对，再结合质谱扫描的分子量，依据此3点，综合前期探讨成果3-8，我们推想1、2、3、4、5、6号峰依次为没食子酸、7-O-没食子酰基-景天庚酮糖、5-羟甲基糠
13、醛、莫诺苷、马钱苷和山茱萸裂苷。质谱数据见表1和表2，质谱图见图5和图6。 4小 结 本试验初步用HPLC-ESI-MS方法分析了山茱萸生品和制品，并指认出了6个化合物，为进一步深化探讨打下基础。 山茱萸生品中无5-羟甲基糠醛，而制品中有，再次验证了山茱萸经蒸制以后产生了新化合物5-羟甲基糠醛。 参考文献 1 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：1部S. 北京:中国医药科技出版社, 2010: 26. 2 杜伟锋，王明艳，蔡宝昌. 山茱萸炮制前后多糖对小鼠免疫功能的影响J. 中药材，2008,31(5):717-719. 3 杜伟锋，丁霞，蔡宝昌. 山茱萸炮制前后有效成分含量改变探讨J. 江
14、苏省博士探讨生学术论坛论文集，2006:471476. 4 杜伟锋，丁霞，蔡宝昌. 山茱萸炮制前后5-羟甲基糠醛的含量改变探讨D. 中成药，2007,29(12):1801-1803. 5 杜伟锋，蔡皓，蔡宝昌. HPLC-DAD 法同时测定山茱萸饮片中5个成分的含量J. 中国药学杂志，2008,43(17):1342-1346. 6 杜伟锋，蔡皓，丁霞，等. RP-HPLC法测定山茱萸生品和酒制品中没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷和马钱素的含量J. 中草药，2008，39(12):18-20. 7 Weifeng Du, Hao Cai, Mingyan Wang, et al. Simul
15、taneous determination of six active components in curde and processed Fructus Corni by high performance liquid chromatography J. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2008,48(1):194-197. 8 杜伟锋，梁小娟，蔡皓，等. 山茱萸炮制前后的HPLC指纹图谱探讨J.中国药学杂志，2009,44(14):1059-1062. 9 梁小娟，杜伟锋，蔡宝昌，等. 山茱萸炮制前后多糖的含量改变探讨J.中药新药与临床药理，2009,20(5):460-462. 10 周莉莉，刘志强，吴国光，等. 山茱萸炮制过程中环烯醚萜苷类成分的质谱探讨J.化学学报，2008,66(24):2712-2716. 11 赵新峰，孙毓庆. 高效液相色谱-电喷雾-质谱法分析山茱萸中的化学成分J.中草药，2008,39(2):180-181.